Е.М. Чудінова, В.А. Платонов, А.В. Александрова, С.Н. Еланский
Нещодавно було показано, що гриб-аскомицетов Ilyonectria crassa здатний вражати бульби картоплі. У роботі вперше проаналізовано біологічні особливості та стійкість до деяких фунгіцидів виділеного з картоплі штаму I. crassa. Послідовності видоспецифічності ділянок "картопляного" штаму збіглися з отриманими раніше для грибів, виділених з коренів нарциса, женьшеню, осики і бука, цибулин лілії і листа тюльпана. Мабуть, багато дикорослі і садові рослини можуть бути резерватами I. crassa. Досліджуваний штам заражав скибочки томата і картоплі, але не інфікував цілий плід томату і неушкоджений бульба картоплі. Це показує, що I. crassa є раневим паразитом. Оцінка стійкості до флудіоксонілу, дифеноконазол і азоксистробін на живильному середовищі показала високу ефективність цих препаратів.
Показник ЕС50 (концентрація фунгіциду, що уповільнює в 2 рази швидкість радіального приросту колонії щодо бесфунгіцідного контролю) дорівнював 0.4; 7.4 і 4 мг / л відповідно. Можливість розвитку захворювання, що викликається I. crassa, слід враховувати при фітопатологичеськой оцінці бульб картоплі і розробці заходів щодо захисту рослин.
Розвиток фітопатогенних мікроорганізмів призводить до високих втрат на всіх етапах вирощування та зберігання картоплі. При плануванні захисних заходів враховуються, як правило, добре відомі збудники хвороб, такі як види пологів Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora та ін. Однак в останні роки з'являється все більше повідомлень про появу на картоплі нових фітопатогенних мікроорганізмів. Їх біологія слабо вивчена, ефективність використовуваних на картоплі фунгіцидів в їх відношенні невідома, методи діагностики не розроблені. При масовому розвитку вони здатні завдати відчутної шкоди врожаю картоплі. Одним з таких мікроорганізмів є гриб-аскомицетов Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, вперше виявлений авторами на бульбах картоплі (Chudinova et al., 2019).
У даній роботі наведені результати аналізу виділеного з бульби картоплі штаму I. crassa. Вивчено морфологія колоній і міцеліальних структур I. crassa, послідовності нуклеотидів видоспецифічності ділянок ДНК, вірулентність до картоплі і томату, стійкість до деяких популярним фунгіцидів.
матеріали та методи
У роботі використаний штам I. crassa 18KSuPT2, виділений в 2018 році з ураженого бульби картоплі, вирощеної в Костромській області. Бульба був вражений по типу сухої гнилі з порожниною, покритої світло-коричневим міцелієм. За допомогою стерильної препаровальной голки міцелій гриба переносили в чашку Петрі з агаризованому середовищем (пивне сусло 10%, агар 1.5%, пеніцилін 1000 од / мл). Інкубували чашки в темряві при 24 ° C.
Для фотографування, оцінки розмірів і морфології спор і органів спороношення використовували світловий мікроскоп Leica DM2500 c цифровою камерою ICC50 HD і бінокулярний мікроскоп Leica M80 з цифровою камерою IC80HD (Leica Microsystems, Німеччина).
Для виділення ДНК міцелій гриба нарощували в рідкої горохової середовищі, після чого заморожували в рідкому азоті, гомогенізували, інкубували в СТАВ буфері, очищали хлороформом, 2 рази промивали 70% спиртом.
Детально метод виділення ДНК описаний в статті Kutuzova et al. (2017).
Для визначення видової приналежності молекулярними методами і порівняння з іншими відомими штамами I. crassa проводили ПЛР з праймерами, що дозволяють ампліфікувати видоспецифічі ділянки ДНК: ITS1-5,8S-ITS2 (праймери ITS5 / ITS4, White et al., 1990), ділянки генів b -тубуліна (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) і фактора елонгації трансляції 1α (tef1α) (праймери EF1-728F / EF1-986R, Carbone and Kohn, 1999). Амплікона потрібної довжини екстрагували з гелю за допомогою набору CleanUp компанії «ЄВРОГЕН». Ампліфіковані ділянки секвенували з використанням набору реактивів BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) на автоматичному секвенатор Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Отримані послідовності нуклеотидів використовували для пошуку відповідності в базі даних GenBank Національного центру біотехнологічної інформації США (NCBI). Філогенетичний аналіз проводили за допомогою програми MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
Визначення вірулентності проводили на цілих зелених плодах великоплідного томата (сорт Діброва) і бульбах картоплі (сорт Гала). Крім того, для імітації поразки пошкоджених плодів і бульб використовували часточки тих же плодів і бульб. Скибочки бульб поміщали у вологі камери, що представляють собою чашки Петрі з мокрою фільтрувальної папером на дні. На папір поміщали предметне скло, на яке, в свою чергу, клали шматочки бульб або плодів. Цілі бульби і плоди також поміщали в контейнери, на дні яких була мокра фільтрувальна папір. У центр скибочки (або на неушкоджену поверхню бульби або плода) поміщали шматочок агару (5 × 5 мм) з гіфами гриба після 5 днів вирощування на сусло-агарі.
Оцінку стійкості штамів грибів до фунгіцидів проводили в лабораторних умовах на агаризованому живильному середовищі. Вивчали сприйнятливість до фунгіцидною препаратів Максим, КС (діюча речовина флудіоксоніл, 25 г / л), Квадріс, КС (азоксистробін 250 г / л), Швидкість, КЕ (дифеноконазол 250 г / л) (Державний каталог ..., 2020). Оцінку проводили в чашках Петрі на середовищі сусло-агар з додаванням досліджуваних препаратів в концентраціях діючої речовини 0.1; 1; 10 ppm (мг / л) (для флудіоксоніл і дифеноконазола), 1; 10; 100 ppm (для азоксистробін) і на середовищі без фунгіциду (контроль). Фунгіцид додавали в розплавлену і охолоджену до 60 ° C середу, після чого середу розливали по чашках Петрі. Агаровий блок з міцелієм гриба поміщали в центр чашки Петрі і культивували при тим-пературі 24 ° C в темряві. Через 7 діб інкубування проводили завмер діаметрів колоній в двох взаємно перпендикулярних напрямках; результати вимірювань для кожної колонії усереднювати. Експерименти виконували в трьох повторностях. За результатами аналізів розраховували показник EC50, що дорівнює концентрації фунгіциду, що знижує в 2 рази швидкість радіального приросту колонії щодо бесфунгіцідного контролю.
Результати та обговорення
На чашках Петрі з сусло-агаром гриб утворював колонії з білим пластівчастим міцелієм. Середовищі під міцелієм фарбувалася в червоно-коричневий колір. При підсиханні середовища гриб формував суперечки двох типів на одиночних і агрегованих в невеликі спородохій конидиеносцах. Макроконідії витягнуті, циліндричні, з одного-трьома септах, середня довжина 27.2 мкм з розкидом значень від 23.2 до 32.2 мкм, ширина - до 4.9 мкм (рис. 1). Середня довжина мікроконідій - 14.3 мкм з розкидом значень від 10.3 до 18.1 мкм, ширина - до 4.0 мкм. Всі макро- і мікроморфологічного ознаки укладаються в діапазон варіювання виду Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Послідовності видоспецифічності ділянок ДНК (ITS, b-тубулін, TEF 1α) повністю співпали з сиквенс раніше досліджених нами штамів I. crassa (Chudinova et al., 2019, табл. 1). З метою вивчення поширеності I. crassa в інших регіонах і аналізу спектру слабости культур були проаналізовані аналогічні послідовності ДНК в базі GenBank (табл. 1). Перекриття склало від 86 до 100%. Сиквенс всіх трьох ділянок ДНК "картопляного" штаму I. crassa були ідентичні послідовностям штамів, виділених з цибулини лілії і коренів нарциса в Нідерландах і з кореня женьшеню в Канаді. Інших штамів I. crassa з трьома проаналізованими аналогічними послідовностями у відкритих базах даних нам виявити не вдалося. Однак аналіз депонованих послідовностей ITS і b-тубуліну показав присутність I. crassa на листках тюльпана в Великобританії. Гриби зі схожою послідовністю ITS були виявлені при аналізі мікобіоти коренів осики в Канаді і бука в Італії, бульб картоплі в Саудівській Аравії (табл. 1). Результати даного дослідження показують, що I. crassa має глобальне поширення і здатний вражати різні види рослин.
При визначенні патогенності на скибочках томата і картоплі на 5 день діаметр поразки досягав 1.5 см. При цьому досліджуваний штам не інфіковані цілий плід томату і неушкоджений бульба картоплі. Однак на томаті спостерігалося ураження чашолистків. Для виключення можливості контамінації з розвиненого на шматочку бульби картоплі міцелію був виділений в чисту культуру ізолят гриба. Він був повністю ідентичний батьківському штаму. Мабуть, I. crassa є раневим паразитом.
Передпосадкова обробка насіннєвих бульб фунгіцидами дозволяє знизити розвиток хвороб на рослинах під час вегетації. Для підбору ефективних фунгіцидів важливо оцінити, які з них ефективні по відношенню до I. сrassa. У роботі вивчені широко поширені діючі речовини фунгіцидів - флудіоксоніл, азоксистробін, дифеноконазол. Флудіоксоніл входить до складу декількох сумішевих препаратів, які використовуються для протруювання насіння і насіннєвих бульб перед посадкою. Флудіоксоніл (препарат Максим) використовується також для обробки насіннєвих бульб перед закладанням на зберігання. Дифеноконазол і азоксистробін також входять до складу ряду препаратів, які використовуються для обробки насіннєвого матеріалу, а також до складу препаратів, призначених для обробки вегетуючих рослин (Державний каталог ..., 2020).
Вивчено швидкість росту I. crassa на середовищах (рис. 2) з різними концентраціями діючих речовин: флудіоксоніл (EC50 = 0.4 ppm), азоксистробін (EC50 = 4 ppm) і дифеноконазол (EC50 = 7.4 ppm) (табл. 2). Ці препарати можна визнати високоефективними щодо I. crassa, так як їх EC50 істотно нижче рекомендованої концентрації препарату в робочій рідині, що використовується для обробки бульб. Згідно з Державним каталогом ... (2020), концентрація флудіоксоніл в рідини для обробки бульб картоплі становить від 500 до 1000 ppm, азоксистробін (в рідини для обробки дна борозни) - 3750-9375 ppm, дифеноконазола (в рідини для обробки вегетуючих рослин) - 187.5- 625 ppm.
Таблиця 1. Подібність сіквенсів видоспецифічності послідовностей штаму 18KSuPT2 і наявних в базі Genbank штамів Ilyonectria crassa
штам | Рослина-господар, місце виділення | Номери сіквенсів, депонованих в GenBank, відсоток подібностей | Посилання | ||
ЙОГО | β-тубулін | TEF 1α | |||
17KSPT1і 18KSuPT2 | Бульба картоплі, Костромська обл. | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, дана робота |
CBS 158/31 | Коріння нарциса, Нідерланди | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., У 2012 |
CBS 139/30 | Цибулина лілії, Нідерланди | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Корінь женьшеню, Канада | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Лист тюльпана, Великобританія | KJ475469 100 | KJ513266 100 | НД | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Коріння осики, Канада | MT294410 100 | НД | НД | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Бук, Італія | KR019363 99.65 | НД | НД | Tizzani, Haegi, Motta. Direct submission |
KAUF19 | Бульба картоплі, Саудівська Аравія | HE649390 98.3 | НД | НД | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
НД = Не депонировано
Таблиця 2. Стійкість Ilyonectria crassa до фунгіцидів
(діюча речовина) | ЕС50, ppm | ||||
3 день | 5 день | 7 день | |||
Контроль | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Квадріс, КС (фзоксістробін) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Максим, КС (флудіоксоніл) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Швидкість, КЕ (дифеноконазол) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
У нашій роботі штами I. crassa були виділені з бульб картоплі в Костромській і Московської (Chudinova et al., 2019) областях. Висока частка штамів грибів з сиквенс ITS, ідентичними I. crassa, була виявлена при аналізі мікобіоти бульб картоплі в Саудівській Аравії (Gashgari, Gherbawy, 2013). Мабуть, I. crassa зустрічається на картоплі не так рідко, як може здатися. У наших експериментах показано, що гриб міг вражати пошкоджені плоди томата. З літературних даних відомо, що I. crassa здатний розвиватися в грунті сапротрофного (Moll et al., 2016), а також вражати різні рослини, навіть такі далекі в таксономическом плані, як нарциси, лілії, женьшень, осика, бук (табл. 1). Мабуть, багато дикорослі і садові рослини можуть бути резерватами I. crassa. Вищесказане показує, що при розробці заходів захисту необхідно враховувати можливість ураження бульб картоплі цим грибом. Широко поширені препарати для обробки бульб картоплі, що містять флудіоксоніл, азоксистробін і дифеноконазол, показали високу фунгіцидну ефективність щодо I. crassa.
Робота виконана за підтримки РФФД (грант № 20-016-00139).
Стаття опублікована в журналі «Вісник захисту рослин», 2020 року, 103 (3)