Д. Ю. Рязанцев, Є. М. Чудінова, Л. Ю. Кокаева, С. Н. Еланский, П. Н. Балабко, Г. Л. Бєлова, С. К. завров
Фітопатогенів гриб Colletotrichum coccodes викликає небезпечні захворювання картоплі і томату, відомі як антракноз і чорна плямистість бульб. За морфологічними ознаками їх часто важко відрізнити від захворювань, що викликаються іншими мікроорганізмами; на зелених плодах томата хвороба може протікати безсимптомно, виявляючись тільки на дозрілих червоних плодах. Для швидкої і точної діагностики збудника пропонується тест-система для ПЛР в реальному часі. Для розробки тест-системи була визначена послідовність нуклеотидів гена гліцеролтріфосфатдегідрогенази 45 штамів C. coccodes, виділених з бульб картоплі в різних регіонах Росії.
На підставі отриманих результатів і аналізу аналогічних послідовностей інших видів, наявних в базі даних GenBank, були сконструйовані видоспецифічі для C. coccodes праймери і зонд. Для перевірки специфічності створеної тест-системи проводили ПЛР з ДНК, виділеної з чистих культур 15 різних видів паразитичних і сапротрофних грибів, асоційованих з рослинами томата і картоплі (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternatа, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Присутність ДНК Colletotrichum coccodes визначалося при пороговому циклі 20-27, тоді як інші види визначалися після 40 циклів або НЕ детектувати. Тест-система дозволяє впевнено детектувати в аналізованої ПЛР-суміші концентрації ДНК C. coccodes, що перевищують 0.01 нг / мм3. За допомогою розробленої тест-системи було досліджено присутність C. coccodes в листі томата з симптомами ураження грибними хворобами і в бульбах картоплі без зовнішніх симптомів захворювання. Листя з симптомами грибного ураження були зібрані з двох різних полів в Краснодарському краї, бульби - з полів в Костромській, Московської, Калузької, Нижегородської областях. У Краснодарському краї був виявлений один лист томата, що містить ДНК C. coccodes; достовірне присутність ДНК цього патогена було виявлено в 5 зразках бульб, вирощених в Костромській, Московської, Калузької областях.
Запровадження
Гриби роду Colletotrichum - небезпечні фітопатогени, що вражають зернові, овочеві культури, трави, багаторічні плодові та ягідні рослини. Один з повсюдно поширених видів цього роду, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, є збудником антракнозу і чорної плямистості картоплі і томату, викликає захворювання і ряду інших рослин сімейства пасльонові, в т.ч. засмічених (Dillard, 1992). C. coccodes вражає всі підземні частини рослини, підстави стебел, листя і плоди (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). На шкірці інфікованих бульб картоплі спостерігається розвиток сірих плям з нечітко вираженими краями, на яких добре видно чорні точки спороношення і мікросклероції. В процесі зберігання в м'якоті бульб можуть утворитися виразки з розм'якшеним вмістом, тобто хвороба переходить в фазу антракноза, що, однак, спостерігається вкрай рідко.
У той же час симптоми антракноза (виразки, покриті шкіркою з дрібними чорними крапками) типові на плодах томата. На листі симптоми ураження С. сoccodes виглядають як плями темно коричневого кольору, зазвичай облямовані тканиною жовтого кольору (Johnson, 1994).
Розвиток чорної плямистості на бульбах псує їх зовнішній вигляд, що є особливо актуальним при продажу митого картоплі краснокожурних сортів. Розшарування шкірки призводить до надмірного випаровування і збільшення втрат при зберіганні (Hunger, McIntyre, 1979). Поразка інших органів рослин призводить до втрат врожаю, що відзначалося в умовах як відкритого, так і закритого грунту (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Захворювання, що викликаються C. coccodes, поширені практично у всіх картофелепроізводящіх регіонах світу, в тому числі і в Росії (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Контроль цих захворювань утруднений через недостатню ефективність існуючих фунгіцидів відносно C. Coccodes і відсутності стійких сортів (Read, Hide, 1995).
Інокулюм C. coccodes може зберігатися в насіннєвих бульбах (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), насінні томата (Ben-Daniel et al., 2010), виживати тривалий час в грунті, на рослинних рештках (Dillard, 1990. ; Dillard, Cobb, 1993) і в засмічених рослинах (Raid, Pennypacker, 1987). Роботами ряду авторів (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) показано, що розвиток захворювання на картоплі і томаті в значній мірі залежить від присутності інокулюму в насіннєвому матеріалі і в грунті. Тому для мінімізації втрат від захворювання необхідна діагностика (в тому числі кількісна) пропагул гриба в насіннєвому матеріалі, в грунті, в які закладаються на зберігання насіннєвих бульбах картоплі і насінні томата. Морфологічна діагностика в грунті і рослинному матеріалі може проводитися тільки по присутності мікросклероції, які, проте, зустрічаються і в інших видів грибів.
Симптоми на бульбах дуже схожі на сріблясту парші, викликану грибом Helminthosporium solani. Виділення Colletotrichum coccodes і Helminthosporium solani в чисту культуру досить складно і займає тривалий час у зв'язку з повільним зростанням на живильному середовищі. Для швидкого виявлення Colletotrichum coccodes необхідне використання інструментальних методів діагностики. Найбільш зручним методом є полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і її модифікація - ПЛР в реальному часі. В даний час в країнах Європи і США використовується тест-система, розроблена англійськими дослідниками (Cullen et al., 2002) до ITS1 ділянці РДНК. Її використання показало хороші результати і при аналізі російських ізолятів (Belov et al, 2018). Однак C. coccodes володіє високою мінливістю і його виявлення по одній послідовності ДНК може привести до хибнонегативних результатів. Для більшої достовірності діагностики необхідний аналіз за кількома видоспецифічності послідовностям ДНК, в зв'язку з чим нами була розроблена оригінальна тест-система, що дозволяє ідентифікувати C. coccodes по послідовності гена глицеральдегид-3-фосфатдегідрогенази.
матеріали та методи
Для оцінки ефективності і специфічності створених тест-систем були використані чисті культури 15 видів грибів, виділених авторами з уражених зразків листя і плодів томата, бульб картоплі (табл. 1). Для виділення брали органи рослин з симптомами грибного ураження, не більше одного органу з куща.
Зріз бульби з шкіркою, скибочку плоду томата, уражений лист поміщали під бінокулярний мікроскоп, після чого гостро заточеним препаровальной голкою міцелій, суперечки або шматочок тканини переносили на щільних середу (сусло-агар) в чашці Петрі. Зберігали ізоляти на скошеної агаризованому середовищі в пробірках при 4 ° С.
Призначені для аналізу зразки листя томата з симптомами ураження грибними хворобами відразу після збору (на полі) поміщали в 70% -й етиловий спирт в якому і зберігали до виділення ДНК. Бульби картоплі доставляли в лабораторію, з них знімали шкірку (шматочок 2 × 1 см) і заморожували на -20 ° С. У замороженому стані зберігали до виділення ДНК.
Чисті культури грибів для виділення ДНК вирощували в рідкому горохової середовищі. Міцелій гриба витягували з рідкого середовища, підсушували на фільтрувальної папері, заморожували в рідкому азоті, гомогенізували, інкубували в СТАВ-буфері, очищали хлороформом, облягали сумішшю ізопропанолу і 0.5м ацетату калію, 2 рази промивали 70% -м спиртом. Отриману ДНК розчиняли в деионизированной воді і зберігали при -20 ° С (Kutuzova et al. 2017). Концентрацію ДНК вимірювали з використанням набору HS DNA quantification kit для двухцепочечной ДНК на Qubit 3.0 (Qiagen, Німеччина). Заспиртовані і заморожені зразки розтирали в рідкому азоті, далі проводили виділення ДНК аналогічно описаному вище (для міцелію чистих культур грибів).
Таблиця 1. Походження використаних в роботі штамів грибів
Назва гриба | Рослина, орган | Місце виділення |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | бульба картоплі | Костромська обл., Бульби картоплі 1-го польового покоління, сорт Ред Скарлетт |
Colletotrichum coccodes 4 | лист картоплі | Респ. Марій Ел, м Йошкар-Ола |
Helminthosporium solani | бульба картоплі | Магаданська обл., Сел. Намет, бульба картоплі |
Cladosporium fulvum | лист томату | Московська обл., Великоплідний томат |
Alternaria tomatophila | плід томату | переданий співробітниками лабораторії мікології і фітопатології ВНДІ захисту рослин |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stem-phylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | плід томату | Краснодарський край, Кримський р-н, сорт Сливка |
Fusarium oxysporum | корінь пшениці | Московська обл. |
ПЛР проводили на ампліфікаторі DTprime (ДНК-Технологія). Для проведення ПЛР використовували оригінальні праймери і зонд на видоспецифічності ділянку гена гліцеролтріфосфат-дегідрогенази: прямий праймер Coc70gdf -TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, зворотний праймер Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGA, зонд Cocgdz - (BHQ1) -AGTGTGCTTGAGA- (FAMdT) -GGGCTGCTGCCG (p). Праймери амплифицируют ділянку розміром 213 вт.
У реакцію брали 50 нг тотальної ДНК (при аналізі листя і бульб) і 10 нг (при аналізі ДНК чистих культур грибів). Реакційна суміш (35 мкл) поділялася парафінової прошарком на дві частини: нижня (20 мкл) містила 2 мкл 10 × реакційного буфера (750 mМ Tris-HCl, рН 8.8; 200 mМ (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 мМ кожного дезоксінуклеотідтріфосфата, 7 пмоль кожного праймера і 4 пмоль гідролізуемого флуоресцентного зонда; верхня содержала1 мкл 10 × буфера для ПЛР та 1 од Taq-полімерази.
Поділ суміші парафіном дозволяє тривалий час зберігати пробірки при температурі 5 ° С і забезпечити гарячий старт ПЛР після їх прогріву протягом 10 хв при температурі вище 80 ° С. ПЛР проводили за наступною програмою: 94.0 ° C - 90 с (1 цикл); 94.0 ° C - 30 с; 64.0 ° C - 15 с (5 цик-лов); 94.0 ° C - 10 с; 64.0 ° C - 15 с (45 циклів); 10.0 ° C - зберігання.
Результати та обговорення
Послідовності гена гліцеролтріфосфатдегідрогенази були визначені у 45 штамів, виділених з листя, стебел, бульб картоплі і плодів томата (Kutuzova, 2018) в різних регіонах Росії. Досліджені послідовності всіх штамів розділилися на 2 групи, що розрізняються двома нуклеотидами. У GenBank депоновані нуклеотидні послідовності представників обох груп за номерами KY496634 і KY496635.
Сконструйовані на їх основі праймери coc70gdf, coc280gdr і зонд cocgdz перевіряли за допомогою програми BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) На всіх наявних у базі GenBank послідовності гена гліцеролтріфосфатдегідрогенази видів роду Colletotrichum і інших організмів.
Ділянок ДНК інших організмів, високо гомологічних праймерів і зонду, виявлено не було.
Чутливість тест-системи перевіряли з використанням проб з різними концентраціями ДНК C. coccodes, ДНК ураженої антракнозом листа картоплі (зібраний в 2017 р в Марій Ел, сорт Ред Скарлетт), і шкірки бульб, уражених чорною плямистістю (зібрані в Костромській обл., сорт Ред Скарлетт, табл. 2). Для підтвердження присутності ДНК в бульбах і в листі картоплі з них були виділені в чисті культури штами C. coccodes.
Результати аналізу чутливості тест-системи показують, що з її допомогою можна успішно діагностувати наявність в зразку ДНК C. coccodes при її сумарному змісті в ПЛР-суміші більш 0.05 нг. Цього цілком достатньо для детекції, оскільки в одному склероции міститься в середньому 0.131 нг, а в одній суперечці - близько 0.04 нг ДНК (Cullen et al., 2002). Тест-система, розроблена англійською групою (Cullen et al., 2002), показала подібну, чутливість (пороговий цикл 34 при 0.05 нг ДНК і 37 при 0.005 нг).
Аналіз природних зразків, що містять C. coccodes у всіх випадках дозволив достовірно ви-явити його присутність в пробі (табл. 2). Запропонований метод виділення ДНК також виявився застосуємо для аналізу природних рослинних зразків.
Таблиця 2. Визначення чутливості запропонованої тест-системи ідентифікації Colletotrichum coccodes для ПЛР в реальному часі
зразок | Кількість ДНК в пробі *, нг | граничний цикл | Детекція C. coccodes |
---|---|---|---|
Міцелій Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Шкірка бульби 1 | 50 | 32 | + |
Шкірка бульби 2 | 50 | 30 | + |
Шкірка бульби 3 | 50 | 31.5 | + |
лист картоплі | 50 | 29.5 | + |
Примітка. * В суміші продуктів ПЛР.
Перевірка специфічності тест-системи проводилася на зразках ДНК, екстрагованої з 15 видів грибів. Всі штами грибів були виділені авторами з уражених і здорових плодів і листя томата, бульб картоплі; один штам був виділений з кореня пшениці (табл. 1). Серед виділених з поверхні плода є і непатогенні для томата види (наприклад, Phellinus ferrugineovelutinus).
Дослідження показали, що ДНК C. coccodes виявлялася при пороговому циклі 20-27, тоді як інші види грибів не детектувати або давали сигнал після 40 циклу, що можна віднести до неспецифическому шумового ефекту (табл. 3).
Таблиця 3. Перевірка тест-системи на грибах різних видів
Назва гриба | граничний цикл |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. кокоди 2 | 22.6 |
C. кокоди 3 | 23 |
C. кокоди 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternatа | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
пеницилл зр. | > 40 |
Примітка. * Кількість ДНК у всіх пробах було 10 нг.
Розроблена тест-система була використана для ідентифікації C. coccodes в зразках листя томата з симптомами ураження некротрофнимі патогенами і бульб насіннєвої картоплі без видимих симптомів. Для дослідження були взяті насіннєві бульби різних сор-тів, вирощених в Костромській, Московської, Калузької, Нижегородської областях. Вірогідним присутність ДНК C. coccodes вважали в зразках, при аналізі яких граничний цикл не перевищував значення 35. Це порогове значення було вибрано виходячи з достовірного визначення 0.05 нг ДНК C. coccodes (пороговий цикл 33.5, табл. 2) і того факту, що при порогових циклах вище 40 діагностувалася неспецифічна ДНК деяких інших видів грибів. При такому підході достовірне присутність ДНК C. coccodes було виявлено в 5 зразках бульб, вирощених в Костромській, Московської, Калузької областях і в одному аркуші томата з Єйського р-ну Краснодарського краю (табл. 4, 5).
Таблиця 4. Детекція Colletotrichum coccodes на бульбах картоплі *
номер зразка | сорт картоплі | Місце виростання | Детекція C. coccodes | граничний цикл |
---|---|---|---|---|
1 | Ред Скарлет | Костромська обл. | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Санте | Московська обл. | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Жуковський ранній | Московська обл. | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Моллі | Калузька обл. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Фантазія | Калузька обл. | - | |
15 | гала | Ніжегородська обл. | - | |
16 | - |
Примітка. * Кількість ДНК у всіх пробах було 50 нг.
Таблиця 5. Детекція Colletotrichum coccodes на листках томата *
номер зразка | Місце виростання | Детекція C. coccodes | граничний цикл |
---|---|---|---|
1 | Краснодарський край, Кримський р-н | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Краснодарський край, Єйський р-н | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Кількість ДНК у всіх пробах було 50 нг.
Створена нами тест-система не поступається розробленої англійськими дослідниками (Cullen et al., 2002) по чутливості і специфічності і підходить для аналізу рослинних зразків. Її застосування для аналізу насіннєвих бульб дозволило виявити ДНК C. coccodes у бульб без зовнішніх ознак ураження і успішно провести аналіз зараженості листя.
У Росії до теперішнього часу не проводили аналізу бульб картоплі на ураженість C. coccodes. Наше вперше проведене дослідження показало, що з 16 протестованих насіннєвих бульб, вирощених в різних регіонах РФ, 5 містять C. coccodes. Це показує, що чорна плямистість бульб картоплі - звичайне захворювання картоплі в Росії, і його роль в зниженні обсягу і якості врожаю картоплі недооцінена.
При аналізі листя томата достовірне присутність ДНК C. coccodes виявлено в одному аркуші з Єйського р-ну Краснодарського краю. Раніше при обстеженні полів томата на півдні Росії за допомогою британської тест-системи (Cullen et al., 2002) були виявлені листя, що містять C. coccodes, причому на деяких полях виявлена висока частка листя, уражених C. coccodes (Belov et al., 2018). У Краснодарському і Приморському краях, Московської області нами були виявлені плоди томата, з яких вдалося виділити чисті культури C. coccodes. Можливо, на томаті в Росії C. coccodes поширений значно ширше, ніж вважається зараз, і його шкідливість також недооцінена.
Таким чином, до теперішнього часу накопичилося достатньо інформації про значне поширення C. coccodes на картоплі і томаті.
Для кращого розуміння ролі цього гриба у розвитку хвороб картоплі та томату необхідний ши-рокій моніторинг поширеності його в Росії, вивчення ролі ґрунтової і насіннєвої інфекції, ролі чорної плямистості у втратах при зберіганні. Застосування ПЛР-діагностики може істотно полегшити проведення цієї роботи, а одночасне застосування обох тест-систем дозволить суттєво збільшити точність аналізу.
Робота підтримана грантом РНФ № 18-76-00009.
Стаття опублікована в журналі «Мікологія і фітопатологія» (том 54, №1, 2020 г.).