С.М. Єланський, Л.Ю. Кокаєва, Н.В. Стацюк, Ю.Т. Дяків
Запровадження
Оомицетов Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - збудник фітофторозу, найбільш економічно важливою хвороби картоплі і томата - вже понад півтора століття привертає пильну увагу дослідників з різних країн. Раптово з'явившись в Європі в середині XIX століття, він викликав епідемію картоплі, що залишилася в пам'яті багатьох поколінь.
До сих пір його часто називають «гриб ірландського голоду». Майже сто років по тому після перших епідемій були виявлені стійкі до фітофторозу дикі мексиканські види картоплі, розроблені методи їх схрещування з культурним картоплею (Muller, 1935) і отримані перші фітофтороустойчівие сорти (Пушкарьов, 1937). Однак незабаром після початку їх комерційного вирощування накопичилися вірулентні до стійким сортам раси збудника фітофторозу. і вводяться в сорту нові гени стійкості з дикого мексиканського картоплі стали швидко втрачати ефективність.
Невдачі з використанням моногенной (вертикальної) стійкості змусили селекціонерів шукати більш складні шляхи експлуатації неспецифічної полігенною (горизонтальної) стійкості. В останні роки в окремих популяціях паразита стали накопичуватися високоагресивних раси, що викликають ерозію навіть неспецифічної стійкості. Поява стійких до фунгіцидів штамів викликало проблеми при використанні хімічних засобів захисту картоплі.
Внаслідок значних відмінностей оомицетов від грибів за хімічним складом, ультраструктурі і метаболізму фунгіциди, особливо системні, що застосовуються для захисту рослин від багатьох грибних хвороб, проти оомицетов неефективні.
Тому в хімічному захисту від фітофторозу використовували багаторазові (до 12 разів за сезон і більше) обприскування контактними препаратами широкого спектру дії. Революційним кроком стало застосування феніламідів, токсичних для оомицетов і системно розповсюджуються в рослинах. Однак повсюдне їх застосування швидко привело до накопичення в грибних популяціях резистентних штамів (Davidse et al., 1981), що істотно ускладнило захист рослин. P. infestans є практично єдиним паразитом помірного пояса, шкода від якого в умовах органічного землеробства неможливо нейтралізувати без застосування хімічних засобів захисту (Van Bruggen, 1995).
Вищесказане пояснює ту величезну увагу, яку приділяють дослідники з різних країн вивченню популяцій P. infestans, динаміці їх чисельності та генетичного складу, а також генетичним механізмам мінливості.
Життєвий цикл Р. INFESTANS
Оомицетов Phytophthora infestans розвиває всередині листя картоплі міжклітинну грибницю з гаусториями. Харчуючись тканинами листа, він викликає утворення темних плям, які у вологу погоду чорніють і загнивають. При сильному ураженні гине весь лист. Після періоду харчування на грибниці утворюються вирости - спорангієносцями - які проростають назовні через продихи. У вологу погоду вони утворюють наліт білого кольору навколо плям з нижньої сторони листків. На кінцях спорангієносцями формуються лімоновідние зооспорангії, які відриваються і розносяться бризками дощу (рис. 1). Потрапляючи в краплі води на поверхні листа картоплі, спорангії проростають 6-8 зооспора, які після періоду руху округлюються, покриваються оболонкою і проростають паросткової трубкою. Росток через продихи проникає в тканину листа. При певних умовах спорангий може проростати паросткової трубкою безпосередньо в тканину листа. При сприятливих умовах час від зараження до утворення нового спороношення складає всього 3-4 дня.
Потрапляючи на землю і профільтровуючи через грунт, спорангії здатні заражати бульби. Сильно уражені бульби при зберіганні згнивають; в слабо уражених інфекція може зберігатися до наступного сезону. Крім того, збудник фітофторозу може зберігатися в зимовий період у вигляді ооспор (товстостінні покояться статеві спори) в грунті на рослинних рештках і на насінні томата. Ооспори утворюються на живих органах рослин при зустрічі штамів різних типів спарювання при надмірному зволоженні. Навесні на посаджених заражених бульбах і на рослинних рештках з ооспор утворюється безстатеве спороношення, зооспори виходять у грунт і викликають зараження нижніх листя рослин. У деяких випадках міцелій може рости з зараженого бульби по зеленій частині рослини і виявлятися, як правило, у верхній частині стебла.
Серйозне відміну оомицетов від більшості грибів полягає в переважанні діплофази в їхньому життєвому циклі з гаметіческой мейозом і проростанням зигот (ооспор) без редукційного поділу ядер. Ця особливість плюс диполярного гетероталлізм, який замінює двостатеві, здавалося б, дозволяють застосувати до оомицетов підходи, розроблені для вивчення популяцій вищих еукаріот (аналіз панмиксии і підрозділів популяцій, внутрішньо-і міжпопуляційних потоків генів і ін.). Однак три фактори не дозволяють повністю переносити ці підходи при вивченні популяцій P. infestans.
1. Поряд з гібридними ооспор в популяціях утворюються самофертильності і партеногенетические ооспори (Fife, Shaw, 1992; Анікіна і ін., 1997а; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Смирнов, 2003), причому частота їх утворення може бути достатньою, щоб вплинути на результати аналізів.
2. Статевий процес у P. infestans вносить незначний внесок в динаміку чисельності популяцій, бо гриб розмножується головним чином вегетативними спорами, утворюючи заРезультати ПЛР-аналізу за допомогою специфічних праймерів більш, ніж на 90% збіглися з результатами аналізу типу спарювання традиційним способом на живильному середовищі . вегетаційний період кілька генерацій безстатевого спороношення (поліциклічне розвиток хвороби). Ооспори грають важливу роль в збереженні організму в період, коли відсутні зелені рослини (взимку) і в первинному зараженні сходів. Потім, протягом літа, відбувається клональное розмноження і збільшення або, навпаки, падіння чисельності окремих клонів, що виникли в результаті статевої рекомбінації, що визначається головним чином відбором більш пристосованих. Тому співвідношення окремих клонів в популяції на початку і кінці епіфітотії може бути абсолютно різним.
3. Описаний цикл характерний для нативних популяцій P. infestans на їх батьківщині - в Центральній Америці. В інших зонах світу протягом більше 100 років статевий процес не був відомий, зимуючої стадією був вегетативний міцелій в заражених бульбах картоплі. Життєвий цикл був повністю агамное, а поширення носило осередкового характеру: інфекція з одиничних заражених висаджених бульб переходила на листя, утворюючи первинні осередки хвороби, які могли зливатися при масовому розвитку захворювання.
Таким чином, в одних регіонах може бути чергування статевого і безстатевого циклів, а в інших - тільки безстатевий цикл.
Походження P. INFESTANS
P. infestans з'явився в Європі в кінці першої половини XIX ст. Оскільки батьківщиною картоплі є Північно-Східна частина Південної Америки, передбачалося, що паразит був привезений звідти до Європи під час буму чилійської селітри. Однак дослідження, виконані на картопляної станції Рокфеллерівського центру в долині Толука (Мексика), змусили переглянути цю точку зору (Niederhauser, 1991, 1993).
1. У долині Толука місцеві клубненосного види картоплі (Solanum demissum, S. bulbocastanum і ін.) Мають різні наборами генів вертикальної стійкості в поєднанні з високим рівнем неспецифічної стійкості, що свідчить про тривалу коеволюції з паразитом. Американські види, включаючи культурний картопля, не мають генів стійкості.
2. У долині Толука зустрічаються ізоляти з типами спарювання А1 і А2, внаслідок чого поширена інтербредная популяція P. infestans; в той час як на батьківщині культурного картоплі, в Південній Америці, паразит поширюється клонально.
3. У долині Толука спостерігаються щорічні жорстокі епідемії фітофторозу. Тому серед північноамериканських дослідників (Корнельский університет) усталилася думка про Мезоамериці (Центральній Америці), як батьківщині картопляної фітофтори (Goodwin et al., 1994).
Американські дослідники не поділяють цю думку. Вони вважають, що культурний картопля і його паразит P. infestans мають спільну батьківщину - південноамериканські Анди. Свою точку зору вони підкріпили молекулярними дослідженнями за аналізом ДНК-поліморфізмів мітохондріального геному (мтДНК) і ядерних генів RAS і β-тубуліну (Gomez-Alpizar et al., 2007). Вони показали, що штами, зібрані в різних місцях світу, походять від трьох дівергентних анцестральной ліній, які (всі три) знайдені в південноамериканських Андах. Андские гаплотипи - нащадки двох ліній: ізоляти найстарішою лінії мтДНК зустрічаються на дикорослих пасльонових з секції Anarrhicomenum в Еквадорі, ізоляти другої лінії поширені на картоплі, томаті і диких пасльонових. В Толука навіть рідкісні гаплотипи відбуваються тільки від однієї лінії, причому генетична варіабельність штамів з Толука (низька алельних частота деяких варіабельних сайтів) свідчить про сильний ефект засновника внаслідок недавнього дрейфу.
Крім того, в Андах знайдений новий вид P. andina, морфологічно і генетично схожий з P. infestans, що, на думку авторів, вказує на Анди, як на гарячу точку видоутворення в роді Phytophthora. Нарешті, в Європі і в США популяції P. Infestans включають обидві андские лінії, в той час як в Толука - тільки одну.
Ця публікація викликала відповідну реакцію групи дослідників з різних країн, які провели велику експериментальну роботу по ревізії раніше виконаного дослідження (Goss et al., 2014 року). У цій роботі, по-перше, для дослідження поліморфізмів ДНК були використані більш інформативні Микросателлитная послідовності ДНК; по-друге, для аналізу кластеризації, шляхів міграції часу розбіжності популяцій та ін. були використані більш досконалі моделі (F-статистика, апроксимації Bayesian'a і ін.) і, по-третє, використано порівняння не тільки з Андским видом P. andina, у якого була встановлена гібридна природа (P. infestans x Phytophthora sp.) , але і з мексиканськими ендеміками P. mirabilis, P. Ipomoeae і Phytophthora phaseoli - генетично близькими P. infestans, що входять в одну кладу (Kroon et al., 2012). В результаті цих аналізів було однозначно показано, що коренева частина філогенетичного дерева всіх узятих в дослідження видів роду Phytophthora, крім гібридного P. andina, належить мексиканським штамів, а міграційний потік має напрямок Мексика - Анди, а не навпаки, і його початок збігається з європейською колонізацією Нового Світу (300-600 років тому). Таким чином, виникнення виду P. infestans, спеціалізованого до поразки картоплі, відбулося у вторинному генетичному центрі формування клубненосного пасльонових, тобто в Центральній Америці.
Геном P. INFESTANS
У 2009 році міжнародною групою вчених був секвенирован повний геном P infestans (Haas et al, 2009), розмір якого склав 240 Мб. Це в кілька разів більше, ніж у близьких видів P. sojae (95 Мб), що викликають кореневу гниль сої, і P. Ramorum (65 Мб), що вражають такі цінні породи дерев, як дуб, бук і деякі інші. Отримані дані показали, що геном містить велику кількість копій повторюваних послідовностей - 74%. У геномі визначені 17797 білок-кодують генів, основну частину яких складають гени, що беруть участь в клітинних процесах, включаючи реплікацію ДНК, транскрипцію і трансляцію білків.
Порівняння геномів роду Phytophthora виявило незвичайну організацію геному, що складається з блоків послідовностей консервативних генів, в яких щільність генів відносно висока, а вміст повторюванихпослідовностей щодо низько, і окремих областей з неконсервативний послідовностями генів, з низькою щільністю генів і високим вмістом повторюваних ділянок. Консервативні блоки складають 70% (12440) всіх кодують білок генів P. infestans. В межах консервативних блоків гени, як правило, розташовані тісно із середнім міжгенних відстанню 604 п.н. У районах між консервативними блоками міжгенних відстань більше (3700 п.н.) внаслідок збільшення щільності повторюваних елементів. Швидко еволюціонують ефекторні секреторні гени розташовані в районах з низьким вмістом генів.
Аналіз послідовностей генома P. Infestans показав, що приблизно одна третина геному належить до мобільних елементів. У геномі P. infestans міститься значно більше різних сімейств транспозони, ніж в інших відомих геномах. Велика частина транспозони P. Infestans належить сімейству Gypsy.
У геномі P. infestans виявлено велику кількість специфічних сімейств генів, які беруть участь в патогенезі. Значна їх частина кодує ефекторні білки, які змінюють фізіологію рослини-господаря і сприяють його інфікування. Вони відносяться до двох великих категорій: апопластіческіе Ефектори, які діють в міжклітинних просторах (апопласта) і цитоплазматичні Ефектори, які потрапляють в клітини за допомогою гаусторій. Апопластіческіе Ефектори включають в себе секретуються гидролитические ензими, такі як протеази, ліпази і глікозілази, які руйнують клітини рослин; інгібітори ензимів захисної системи рослини-господаря і некротизуючий токсини, такі як Nep1 подібні білки (NPLs) і Pcf-подібні невеликі білки, багаті цистеїном (SCRs).
Ефекторні гени P. infestans численні і зазвичай більшого розміру в порівнянні з непатогенних генами. Найбільш відомі цитоплазматические Ефектори RXLR і Crinkler (CNR). Типовими для оомицетов цитоплазматическими ефекторами є RXLR білки. Всі відкриті до цих пір гени RXLR ефекторів містять аміно-термінальну групу Arg-XLeu-Arg, де Х являє собою амінокислоту. В результаті дослідження було висловлено припущення про наявність 563 RXLR генів в геномі P. infestans, що на 60% більше, ніж у P. sojae і P. ramorum. Приблизно половина RXLR генів в геномі P. infestans є видоспецифічними. RXLR Ефектори відрізняються великою різноманітністю послідовностей. Серед них виявлено одне велике і 150 невеликих родин. На відміну від основного протеома, гени RXLR ефекторів зазвичай розташовуються в областях генома, бідних генами і багатих повторами. Мобільні елементи, які обумовлюють динамічність цих регіонів, сприяють рекомбінації в цих генах.
Цитоплазматичні CRN Ефектори були спочатку визначені в транскриптах P. infestans, що кодують пептиди, що викликають некроз тканин рослини. З моменту їх відкриття було мало відомо про сімействі цих ефекторів. Аналіз генома P. Infestans виявив величезну сімейство з 196 CRN генів, що значно більше, ніж у P. sojae (100 CRN) і P. ramorum (19 CRN). Як і RXLR, CRN є модульними білками і складаються з високо консервативного N-термінального LFLAK домену (50 амінокислот) і поруч розташованого домену DWL, що містить різні гени. Більшість CRN (60%) мають сигнальним пептидом.
Була вивчена можливість різних CRN порушувати клітинні процеси рослини-господаря. При аналізі некрозів рослини видалення CRN2 білків дозволило ідентифікувати С-кінцевий регіон, що складається з 234 амінокислот (позиції 173-407, домен DXG) і викликає загибель клітин. Аналіз CRN-генів P. infestans дозволив виявити чотири різних С-кінцевих регіону, які також викликають загибель клітин всередині рослини. До них відносяться вперше визначені DC домени (у P. Infestans 18 генів і 49 псевдогенов), а також D2 (14 і 43) і DBF (2 і 1) домени, які мають подібністю з білками кіназами. Білки CRN-доменів, експресуються в рослині, зберігаються (за відсутності сигнальних пептидів) в рослинній клітині і стимулюють загибель клітин по внутрішньоклітинного механізму. Ще 255 містять CRN-доменів послідовностей швидше за все не функціонують як гени.
Збільшення числа і розміру сімейств ефекторних генів RXLR і CRN було, імовірно, обумовлено, неалельні гомологичной рекомбинацией і дублюванням генів. Незважаючи на те, що в геномі міститься велика кількість активних мобільних елементів, до сих пір немає прямих доказів перенесення ефекторних генів.
Методи, що застосовуються при вивченні структури популяцій
Вивчення генетичної структури популяцій в даний час грунтується на аналізі чистих культур входять до неї штамів. Аналіз популяцій без виділення чистих культур також проводиться з певною метою, такими, наприклад, як вивчення агресивності популяції або присутності в ній стійких до фунгіцидів штамів (Філіппов та ін., 2004, Деревягина і ін., 1999). Такий тип досліджень передбачає використання спеціальних методів, опис яких виходить за рамки пропонованого огляду. Для порівняльного аналізу штамів використовують ряд методів, заснованих як на аналізі структури ДНК, так і на вивченні фенотипічних проявів. При порівняльному аналізі популяцій доводиться мати справу з великою кількістю ізолятів, що накладає певні вимоги на використовувані методи. В ідеалі вони повинні відповідати наступним вимогам (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- бути дешевими, нескладними у виконанні, не вимагати значних часових затрат, базуватися на загальнодоступних технологіях (наприклад, ПЦР);
- повинні генерувати достатньо велике число незалежних кодомінантних маркерних ознак;
- мати високу відтворюваність;
- використовувати мінімальну кількість досліджуваної тканини;
- бути специфічними до субстрату (наявне в культурі забруднення не повинно впливати на результати);
- не вимагати застосування небезпечних процедур і сильно токсичних хімікатів.
Методів, які відповідають усім перерахованим вище параметрам, на жаль, не існує. Для порівняльного дослідження штамів в наш час використовуються методи, засновані на аналізі фенотипічних ознак: вірулентність до сортам картоплі і томата (картопляні і томатні раси), тип спаровування, спектри ізоферментів пептідази і глюкозо-6-фосфатізомерази, і на аналізі структури ДНК: поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів (RFLP), який зазвичай доповнюють гібридизаційним пробою RG 57, аналіз мікросателітних повторів (SSR і InterSSR), ампліфікація з випадковими праймерами (RAPD), ампліфікація рестрикційних фрагментів (AFLP), ампліфікація з праймерами, гомологічними послідовностями мобільних елементів (наприклад, Inter SINE PCR), визначення гаплотипов мітохондріальної ДНК.
Нам інформацію про те методів порівняльного дослідження штамів, що застосовуються в роботі з P. Infestans
Фенотипічні маркерні ознаки
"Картопляні" раси
"Картопляні" раси являють собою часто досліджуваний і використовуваний маркер. "Прості картопляні" раси мають один ген вірулентності до картоплі, "складні" - не менше двох. Black зі співавторами (1953), узагальнивши всі наявні у них дані, встановили, що раса фітофтори здатна тпоражать рослини з геном / генами стійкості, відповідні гену / генам вірулентності P. infestans, і виявили раси 1, 2, 3 і 4, що вражають рослини з генами R1, R2, R3 і R4, відповідно, тобто взаємодія між паразитом і господарем відбувається за принципом "ген на ген". Далі Black за участю Gallegly і Malcolmson відкрили гени стійкості R5, R6, R7, R8, R9, R10 і R11 а також відповідні їм раси (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
За расовому складу збудника з різних регіонів існує великий масив даних. Чи не аналізуючи ці дані детально, зазначимо лише загальну тенденцію: там, де використовували сорти з новими генами стійкості або їх комбінаціями, спочатку мало місце деяке ослаблення фітофторозу, але потім з'являлися і відбиралися раси з відповідними генами вірулентності і спалаху фітофторозу поновлювалися знову. Специфічна вірулентність проти перших 4 генів стійкості (R1-R4) рідко відзначалася в колекціях, зібраних до введення в культуру сортів з цими генами, але кількість вірулентних штамів різко збільшувалася при паразитуванні патогена на сортах, які несуть ці гени. Гени 5-11, навпаки, зустрічалися в колекціях досить часто (Shaw, 1991).
Дослідження співвідношення різних рас протягом вегетаційного сезону, проведене в кінці 1980-х років, показало, що на початку розвитку захворювання в популяції переважають клони з низькою агресивністю і 1-2 генами вірулентності.
Далі, у міру розвитку фітофторозу, концентрація вихідних клонів зменшується і збільшується число "складних" рас з високою агресивністю. Зустрічальність останніх до кінця сезону досягає 100%. При зберіганні бульб відбувається зменшення агресивності і втрата окремих генів вірулентності. Динаміка заміщення клонів може відбуватися на різних сортах по-різному (Рибакова & Дьяков, 1990). Однак проведені нами в 2000-2010 роках дослідження показали, що складні раси зустрічаються з самого початку епіфітотії серед штамів, виділених як з картоплі, так і з томата. Ймовірно, це пов'язано зі зміною популяцій P. Infestans в Росії.
До 1988-1995 років зустрічальність "суперрас", мають всі або майже всі гени вірулентності, в різних регіонах досягала 70-100%. Така ситуація відзначалася, наприклад, в Білорусі, в Ленінградській, Московській областях, в Північній Осетії і в Німеччині (Іванюк та ін., 2002a, 2002b; Політико, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
"Томатні" раси
У сортів томата вдалося виявити тільки 2 гена стійкості до фітофторозу - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) і Ph2 (Al-Kherb, 1988). Як і у випадку з картопляними расами, взаємодія між томатами і P. infestans відбувається за принципом "ген на ген". Раса T0 заражає сорти, у яких немає генів стійкості (більшість промислово використовуваних сортів), раса Т1 заражає сорти з геном Ph1 (Оттава), раса Т2 - сорти з геном Ph2.
У Росії на картоплі виявляли майже виключно Т0; на томатах на початку сезону переважала Т0, але пізніше вона заміщалася расою Т1 (Дьяков і ін., 1975, 1994). Після 2000 року Т1 на картоплі в багатьох популяціях стала зустрічатися на самому початку епіфітотії. У США на картоплі зустрічалися штами, непатогенні до томату, а також раси Т0, Т1 і Т2, а на томатах переважали Т1 і Т2 (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Тип спарювання
Для проведення дослідження необхідні тестерної (референтні) штами з відомими типами спарювання - А1 і А2. Досліджуваний ізолят висівається з ними попарно в чашки Петрі з вівсяної агаризованому середовищем. Після інкубації протягом 10 днів чашки вивчають на наявність або відсутність ооспор в середовищі в зоні контакту штамів. Можливі 4 варіанти: штам відноситься до типу спарювання А1, якщо він утворює ооспори з тестером А2, до А2, якщо утворює ооспори з тестером А1, до А1А2, якщо утворює ооспори з обома тестерами, або є стерильним (00), якщо не утворює ооспор ні з одним тестером (останні дві групи зустрічаються рідко).
Для більш швидкого визначення типів спарювання робилися спроби виявлення ділянок геному, пов'язаних з типом спаровування, з метою їх подальшого використання для визначення типу спарювання методом ПЛР. Одними з перших успішний експеримент по виявленню подібного ділянки провели американські дослідники (Judelson et al., 1995). З використанням методу RAPD вони змогли ідентифікувати регіон W16, пов'язаний з типом спаровування у нащадків двох схрещується ізолятів, і сконструювати пару 24-нуклеотидних праймерів для його ампліфікації (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') і W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 '). Після рестрикції ПЛР-продукту за допомогою рестриктаз HaeIII вдавалося розділити ізоляти з типами спарювання А1 і А2.
Інша спроба отримати ПЛР-маркери для визначення типів спарювання була зроблена корейськими дослідниками (Kim, Lee, 2002). Ідентифікацію специфічних продуктів вони проводили з використанням методу AFLP. В результаті була розроблена пара праймерів PHYB-1 (forward) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') і PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), що дозволяють вибірково ампліфікувати ділянку генома, пов'язаний з А2 типом спаровування. Надалі вони продовжили цю роботу і сконструювали праймери 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, forward) і 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), що дозволяють вибірково ампліфікувати ділянку Mat-A1, характерний для штамів з типом спаровування А1. Використання ПЛР-діагностики типів спарювання показало хороші результати при дослідженні популяцій P. infestans в Чехії (Mazakova et al., 2006), Тунісі (Jmour, Hamada, 2006) та інших регіонах. У нашій лабораторії (Мица, Еланский, не опублікована) були проаналізовані 34 штаму P. infestans, виділені з уражених органів картоплі і томата в різних регіонах Росії (Костромська, Рязанська, Астраханська, Московська області). Результати ПЛР-аналізу за допомогою специфічних праймерів більш, ніж на 90% збіглися з результатами аналізу типу спарювання традиційним способом на живильному середовищі.
Таблиця 1. Варіабельність стійкості всередині клону Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Місце збору зразків | Кількість проаналізованих ізолятів | Кількість чутливих (S), слабостійких (SR) і стійких (R) штамів, шт (%) | ||
S | SR | R | ||
Г. Владивосток | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
Г. Чита | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Г. Іркутськ | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
Г. Красноярськ | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Г. Єкатеринбург | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
О. Сахалін | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Омська обл. | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Стійкість до металаксилу як популяційний маркер
На початку 1980-х років в самих різних регіонах були відзначені потужні спалахи фітофторозу, викликані стійкими до металаксилу штамами P.infestans. Бульбоносних господарства багатьох країн зазнали відчутних втрат (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Деревягина, 1991). З тих пір в багатьох країнах світу ведеться постійний моніторинг народження стійких до феніламідних препаратів штамів в популяціях P. infestans. Крім практичної оцінки перспектив застосування феніламідсодержащіх препаратів, побудови системи захисних заходів і прогнозування епіфітотій, стійкість до цих препаратів стала одним з маркерних ознак, широко використовуваних для порівняльного аналізу популяцій цього патогена. Однак використання стійкості до металаксилу в порівняльних дослідженнях популяцій слід проводити з урахуванням того, що: 1 - генетичні основи стійкості ще точно не визначені, 2 - стійкість до металаксилу - ознака селективно залежний, здатний змінюватися в залежності від застосування феніламідів, 3 - зафіксовані різні по ступеня чутливості до металаксилу штами всередині однієї клональной лінії (табл. 1).
спектри ізоферментів
Ізоферментні маркери зазвичай незалежні від зовнішніх умов, показують спадкоємство Менделя і є Кодомінантність, що дозволяють розрізняти гомо- і гетерозиготи. Використання білків як генних маркерів дозволяє виявляти як великі реорганізації генетичного матеріалу, включаючи хромосомні і геномні мутації, так і поодинокі амінокислотні заміни.
Електрофоретичні дослідження білків показали, що більшість ферментів існують в організмах у вигляді декількох розрізняються по електрофоретичної рухливості фракцій. Ці фракції - результат кодування множинних форм ферментів різними локусами (ізозімов або ізоферменти) або різними алелями одного локусу (аллозіми або аллоферменти). Тобто ізозімов - це різні форми одного ферменту. Різні форми мають однакову каталітичну активність, але трохи розрізняються за одиничними амінокислотним замін у складі пептиду і по заряду. Такі відмінності виявляються при проведенні електрофорезу.
При дослідженні штамів P. infestans використовують спектри ізоферментів двох білків - пептідази і глюкозо-6-фосфат ізомерази (цей фермент в російських популяціях мономорфен, тому методи його вивчення в даній роботі не наводяться). Для їх поділу на ізозімов в електричному полі на пластину гелю, вміщену в електричне поле, наносять білкові препарати, виділені з досліджуваних організмів. Швидкість дифузії в гелі окремих білків залежить від заряду і молекулярної маси, тому в електричному полі відбувається поділ суміші білків на окремі фракції, які можна візуалізувати за допомогою спеціальних барвників.
Дослідження изоферментов пептідази проводиться на целюлозно-ацетатних, крохмальних або поліакриламідних гелях. Найбільш зручним є метод, заснований на використанні паперово-ацетатних гелів, які здійснює фірма Helena Laboratories Inc. Він не вимагає великих кількостей досліджуваних матеріалів, дозволяє отримувати контрастні смуги на гелі після електрофорезу для обох локусів ферменту, його проведення не вимагає великих тимчасових і матеріальних витрат (рис. 2).
Невеликий шматочок міцелію переноситься в мікропробірку на 1,5 мл, до нього додається 1-2 краплі дистильованої води. Після цього зразок гомогенізується (наприклад, електродрилем з пластмасовою насадкою, що підходить до мікропробірку) і осідає протягом 25 секунд на центрифузі при 13000 об / хв. З кожної мікропробіркі по 8 мкл. супернатанта переноситься на плашку аплікатора.
Целюлозно-ацетатний гель виймають з контейнера з буфером, промокають між двома листами фільтрувального паперу і поміщають робочим шаром вгору на пластмасову базу аплікатора. Розчин з плашки переноситься аплікатором на гель 2-4 рази. Гель переміщують в електрофорезне камеру,
Таблиця 2. Склад розчину, застосовуваного для забарвлення целлюлозо-ацетатного гелю при аналізі изоферментов пептідазина край гелю поміщають краплю фарби (бромфеноловий синій).
TRIS HCl, 0,05M, Ph 8,0 2 мл
Peroxidase 1000 U / ml 5 крапель
o-dianisidine, 4 mg / ml 8 крапель
MgCl2, 20 mg / ml 2 краплі
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 крапель
L-amino-acid oxidase, 20 u / ml 2 краплі
Електрофорез проводиться протягом 20 хв. при 200 В. Після електрофорезу гель переноситься на фарбувальний столик і забарвлюється спеціальним фарбувальних розчином (табл. 2). 10 мл 1,6% DIFCO агару попередньо розплавляють в СВЧ печі, остуджують до 60 ° С, після чого 2 ml агару змішують з фарбувальної сумішшю і виливають на гель. Протягом 15-20 хв проявляються смужки. Реактив L-amino-acid oxidase додають безпосередньо перед змішуванням розчину з розплавленим агаром.
У російських популяціях локус РЕР 1 представлений генотипами 100/100 і 92/100. Гомозигота 92/92 зустрічається вкрай рідко (близько 0,1%). Локус РЕР 2 представлений трьома генотипами 100/100, 100/112 і 112/112, причому всі 3 варіанти зустрічаються досить часто (Elanky, Smirnov, 2003 рис. 2).
дослідження генома
Поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів з подальшою гібридизацією (RFLP-RG 57)
Тотальну ДНК обробляють рестриктазой Eco R1, фрагменти ДНК розділяють за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Ядерна ДНК дуже велика і має багато повторюваних послідовностей, в зв'язку з чим безпосередній аналіз численних фрагментів, отриманих під дією рестриктаз, проводити складно. Тому розділені в гелі фрагменти ДНК переносять на спеціальну мембрану і використовують для гібридизації з зондом RG 57, до складу якого входять нуклеотиди, мічені радіоактивними або флуоресцентними мітками. Цей зонд гибрідизуючою з багаторазово повторюваними послідовностями геному (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Після візуалізації результатів гібридизації на світло або радіоактівночувствітельном матеріалі виходить многолокусний профіль гібридизації (fingerprinting), представлений 25-29 фрагментами (Forbes et al., 1998). Безстатеве (клонових) потомство буде мати однакові профілі. По розташуванню смуг на електрофореграмме судять про подібність і відмінності порівнюваних організмів.
Гаплотипи мітохондріальної ДНК
У більшості еукаріотів мтДНК представлена у вигляді двуцепочечной кільцевої молекули ДНК, яка на відміну від ядерних хромосом еукаріотів реплицируется напівконсервативним і не пов'язана з білковими молекулами.
Мітохондріальний геном P. infestans був секвенирован, ряд робіт був присвячений аналізу довжин рестрикційних фрагментів (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Після того як Griffith і Shaw (1998) розробили нескладний і швидкий метод визначення гаплотипов mtDNA, цей маркер став одним з найпопулярніших в дослідженнях P. Infestans Суть методу полягає в послідовній ампліфікації двох фрагментів мітохондріальної ДНК (із загального генома) праймерами F2-R2 і F4-R4 (табл. 3) і їх подальшої рестрикції за допомогою рестриктаз MspI (1-й фрагмент) і EcoR1 (2-й фрагмент). Метод дозволяє виділити 4 гаплотипу: Ia, IIa, Ib, IIb. Тип II відрізняється від типу I присутністю вставки розміром тисячі вісімсот вісімдесят одна пн і іншим розташуванням сайтів рестрикції в регіонах Р1881 і Р2 (рис. 4).
Починаючи з 1996 року серед штамів, зібраних на території Росії, відзначалися тільки гаплотипи Ia і IIa (Elansky et al., 2001., 2015). Їх можна ідентифікувати після поділу продуктів рестрикції з праймером F2-R2 в електричному полі (рис. 4, 5). Типи мтДНК використовуються при порівняльному аналізі штамів і популяцій. У ряді робіт типи мітохондріальної ДНК були використані для виділення клональних ліній і паспортизації ізолятів P. infestans (Botez et al., 2007; Шеїн та ін., 2009). Використовуючи PCR-RFLP метод був зроблений висновок про гетерогенності мтДНК в одному і тому ж штамі P. infestans (Еланский, Мілютіна, 2007). Умови ампліфікації: 1x (500 сек. 94 ° С), 40x (30 сек. 90 ° С, 30 сек. 52 ° С, 90 сек. 72 ° С); 1x (5 хв. 72 ° С). Реакційна суміш: (20 мкл): 0,2U Taq ДНК полімерази, 1х 2,5 мМ MgCl2-Taq-буфер, 0,2 мМ кожного dNTP, 30 пМ праймера і 5 нг досліджуваної ДНК, деіонізованной вода - до 20 мкл.
Рестрикція ПЛР-продукту проводиться протягом 4-6 годин при температурі 37 ° С. Суміш для рестрикції (20 мкл): 10x MspI (2 мкл), 10х буфер для рестрикції (2 мкл), деіонізованной вода (6 мкл), ПЛР-продукт (10 мкл).
Таблиця 3. Праймери, що використовуються для ампліфікації поліморфних регіонів mtDNA
локус | Праймер | Довжина праймера і його розміщення | Довжина ПЛР продукту | рестріктаза |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4: 5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Ампліфікація з випадковими праймерами (RAPD)
При проведенні RAPD використовують один праймер (іноді - кілька праймерів одночасно) з довільною послідовністю нуклеотидів, довжиною, як правило, 10 нуклеотидів, з високим вмістом (від 50%) GC-нуклеотидів і низькою температурою відпалу (близько 35ºС). Такі праймери «сідають» на численні компліментарні сайти в геномі. Після ампліфікації виходить велика кількість амплікон. Їх число залежить від використовуваного праймера (праймерів) і умов реакції (концентрації MgCl2 і температури відпалу).
Візуалізацію амплікон проводять разгонкой в поліакриламідному або агарозному гелі. При проведенні RAPD аналізу необхідно ретельно стежити за чистотою аналізованого матеріалу, тому що контамінація іншими живими об'єктами може викликати значне збільшення числа артефактів, яких і при аналізі чистого матеріалу досить багато (Perez et al, 1998). Використання цього методу при дослідженні генома P. infestans відображено в багатьох роботах (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002 Carlisle et al., 2001). Підбір умов реакції і праймерів (досліджений 51 10-нуклеотідний праймер) наведено в статті Abu-El Samen et al., (2003).
Аналіз мікросателітних повторів (SSR)
Микросателлитная повтори (simple sequence repeats, SSR) представляють собою тандемно повторювані короткі послідовності з 1-3 (іноді до 6) нуклеотидів, присутні в ядерних геномах всіх еукаріот. Кількість наступних один за одним повторів може варіювати від 10 до 100. Микросателлитная локуси зустрічаються з досить високою частотою і більш-менш рівномірно розподілені по всьому геному (Lagercrantz et al., 1993). Поліморфізм мікросателітних послідовностей пов'язаний з відмінностями в числі повторів базового мотиву. Микросателлитная маркери відносяться до Кодомінантність, що дозволяє використовувати їх для аналізу структури популяції, визначення спорідненості, шляхів міграції генотипів і т.п. Серед інших достоїнств цих маркерів слід зазначити їх високий поліморфізм, хорошу відтворюваність, нейтральність і можливість проведення автоматичного аналізу та оцінки Аналіз поліморфізму мікросателітних повторів здійснюється методом ПЛР-ампліфікації з використанням праймерів, комплементарних унікальним послідовностям, фланкирующим Микросателлитная локуси. Спочатку аналіз проводили з поділом продуктів реакції на поліакриламідному гелі. Пізніше співробітниками компанії Applied Biosystems було запропоновано використовувати флуоресцентно мічені праймери з детекцією продуктів реакції за допомогою автоматичного лазерного детектора (Diehl et al., 1990), а потім і стандартних автоматичних ДНК-секвенаторов (Ziegle et al., 1992). Мічення праймерів різними флуоресцентними барвниками дозволяє аналізувати відразу кілька маркерів на одній доріжці і, відповідно, істотно збільшити продуктивність методу і підвищити точність аналізу.
Перші публікації, присвячені використанню SSR аналізу для дослідження P. infestans, з'явилися на початку 2000 рр. (Knapova, Gisi, 2002). Не всі запропоновані авторами маркери показали достатній рівень поліморфізму, проте два з них (4B і G11) були включені в набір з 12 SSR-маркерів, запропонований в роботі Lees і ін. (2006) і згодом прийнятий в дослідницькій мережі Eucablight (www.eucablight .org) в якості стандарту для P. infestans. Через кілька років було опубліковано дослідження, присвячене створенню системи мультиплексного аналізу ДНК P. infestans на основі восьми SSR-маркерів (Li et al., 2010). Нарешті, після проведення оцінки всіх запропонованих раніше маркерів і відбору найбільш інформативних з них, а також здійснення оптимізації праймерів, флуоресцентних міток і умов ампліфікації, цей же колектив авторів представив систему одностадійного мультиплексного аналізу, що включає 12 маркерів (табл. 4; Li et al. , 2013a). Використовувані в цій системі праймери були підібрані і позначені одним з чотирьох флуоресцентних маркерів (FAM, VIC, NED, PET) таким чином, щоб діапазони розмірів алелей праймерів з однаковими мітками не перекривали.
Автори проводили аналіз на ампліфікаторі PTC200 (MJ Research, США) з використанням наборів QIAGEN multiplex PCR або QIAGEN Typeit Microsatellite PCR. Обсяг реакційної суміші становив 12.5 мкл. Умови ампліфікації були наступними: для QIAGEN multiplex PCR: 95ºС (15 хв), 30х (95ºС (20 с), 58ºС (90 с), 72ºС (60 с), 72ºС (20 хв); для QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95ºС (5 хв), 28х (95ºС (30 с), 58ºС (90 с), 72ºС (20 с), 60ºС (30 хв).
Поділ і візуалізацію ПЛР-продуктів здійснювали з використанням автоматичного капілярного ДНК-аналізатора ABI3730 (Applied Biosystems).
Таблиця 4. Характеристики 12 стандартних SSR-маркерів, які використовуються для генотипування P. Infestans (Li et al., 2013a)
Назва | Кількість алелей | діапазон розміру алелей (п.н.) | праймери |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | F: FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | F: FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | F: FAM-TCTTGTTCGAGTATGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Приклад візуалізації результатів аналізу показаний на рис. 6. Результати аналізували за допомогою програми GeneMapper 3.7 шляхом порівняння отриманих даних з даними відомих ізолятів. Для полегшення інтерпретації результатів аналізу в кожне дослідження необхідно включати 1-2 референтних ізоляту з відомим генотипом.
Запропонований метод дослідження був протестований на значній кількості польових зразків, після чого автори здійснили стандартизацію протоколів між лабораторіями двох організацій, The James Hutton Institute (Великобританія) і Wageningen University & Research (Нідерланди), що, поряд з можливістю використання стандартних FTA-карт для спрощеного збору і пересилки зразків ДНК P. infestans, дозволило говорити про можливість комерційного використання цієї розробки. Крім того, швидкий і точний метод генотипування ізолятів P. Infestans з використанням мультиплексного SSR-аналізу забезпечив можливість проведення стандартизованих досліджень популяцій даного патогена в глобальних масштабах, а створення світової бази даних по фітофтори в рамках проекту Eucablight (www.eucablight.org), що включає , в тому числі, результати Микросателлитная аналізу, дозволило відстежувати появу і поширення нових генотипів в усьому світі.
Поліморфізм довжин ампліфикувати рестрикційних фрагментів (AFLP). AFLP (amplified fragment length polymorphism) - технологія отримання випадкових молекулярних маркерів з використанням специфічних праймерів. При AFLP ДНК обробляють комбінацією з двох рестриктаз. Специфічні адаптери лигируют з "липкими" кінцями рестрикційних фрагментів.
Потім ці фрагменти амплифицируют, використовуючи праймери, комплементарні послідовності адаптера і сайту рестрикції, і несучі додатково одне або більше випадково вибраних підстав на їх 3'-кінцях. Набір отриманих фрагментів залежить від рестриктаз і випадково вибраних нуклеотидів на 3'-кінцях праймерів (Vos et al., 1995). AFLP -генотіпірованіе застосовують для швидкого вивчення генетичної мінливості різних організмів.
Детальний опис методу наведено в роботах Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Велика робота, що дозволяє порівняти дозвіл методів AFLP і SSR, була проведена китайськими ісследователяімі. Були вивчені фенотипічні і генотипические особливості 48 ізолятів P. infestans, зібрані в п'яти областях Північного Китаю. За AFLP- спектрами було виявлено вісім різних генотипів ДНК, на відміну від SSR- генотипів, за якими різноманітності виявлено не було (Guo et al., 2008).
Ампліфікація з праймерами, гомологічними послідовностями мобільних елементів
Маркери, отримані на основі послідовностей ретротранспозонов, дуже зручні для генетичного картування, вивчення генетичної різноманітності і процесів еволюції (Schulman, 2006). Якщо зробити праймери, комплементарні стабільним послідовностям тих чи інших мобільних елементів, можна ампліфікувати ділянки геному, що знаходяться між ними. У дослідженнях збудника фітофторозу успішно застосовувався метод ампліфікації ділянок геному за допомогою праймера, комплиментарного коровою послідовності ретропазона SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) (Лаврова, Еланский, 2003). За допомогою даного методу виявлялися відмінності навіть у бесполом потомство одного ізоляту. У зв'язку з цим було зроблено висновок про високу специфічність методу інтер - SINE - ПЛР і високій швидкості переміщення SINE - елементів в геномі Phytophthora.
У геномі P. infestans виявлено 12 родин коротких ретротранспозонов (SINEs); досліджено видове розподіл коротких ретротранспозонов, виявлені елементи (SINEs), які зустрічаються в геномі тільки P. infestans (Лаврова, 2004).
Особливості застосування методів порівняльного дослідження штамів в популяційних дослідженнях
При плануванні дослідження треба чітко уявляти цілі, які воно переслідує, і використовувати відповідні методи. Так, деякі методи дозволяють генерувати велику кількість незалежних маркерних ознак, але при цьому мають низьку відтворюваність і сильно залежать від використовуваних реактивів, умов реакції, забрудненості досліджуваного матеріалу. Тому в кожному дослідженні групи штамів необхідно використовувати кілька стандартних (референтних) ізолятів, але навіть і в цьому випадку результати декількох експериментів дуже складно об'єднати.
До цієї групи методів можна віднести RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Після ампліфікації виходить велика кількість фрагментів ДНК різного розміру. Подібні методики доцільно використовувати в разі необхідності встановлення відмінностей між спорідненими штамами (батьки-нащадки, дикий тип-мутанти, і т.д), або у випадках, коли необхідний детальний аналіз невеликої вибірки. Так, метод AFLP широко використовується при генетичному картуванні P. infestans (van der Lee et al., 1997) і при внутріпопуляціонних дослідженнях (Knapova, Gisi, 2002 Cooke et al, 2003 Flier et al, 2003). Такі методи недоцільно використовувати при створенні баз даних штамів, тому що практично неможливо уніфікувати облік результатів під час проведення аналізів в різних лабораторіях.
При уявній простоті і швидкості виконання (виділення ДНК без гарної очищення, ампліфікація, візуалізація результатів) ця група методів вимагає застосування спеціального методу документування результатів: разгонки в поліакриламідному гелі з міченими (радіоактивно або люмінесцентна) праймерами і подальшої засвічення світло- або радіоактівночувствітельного матеріалу. Звичайний метод візуалізації в агарозному гелі з бромистим етидієм для цих методів, як правило, непридатний, тому що велике число фрагментів ДНК різного розміру може зливатися.
Інші методи, навпаки, дозволяють генерувати мале число ознак при їх дуже високою відтворюваності. До цієї групи можна віднести дослідження гаплотипов мітохондріальної ДНК (в Росії відзначені тільки два гаплотипу Ia і IIa), типу спарювання (більшість ізолятів поділяються на 2 типи: А1 і А2, рідко зустрічаються самофертильності SF) і спектрів изоферментов пептідази (два локусу Pep1 і Pep2 , що складаються з двох ізозімов кожен) і глюкозо-6-фосфат ізомерази (в Росії варіабельності за цією ознакою немає, хоча в інших країнах світу відзначається значний поліморфізм). Ці ознаки доцільно використовувати при аналізі колекцій, складанні баз даних регіонального та світового масштабу. У разі аналізу ізоферментів ігаплотіпов мітохондріальної ДНК можна обійтися взагалі без стандартних штамів, в той час як при аналізі типів спарювання необхідно два тестерної ізоляту з відомими типами спарювання.
Умови реакції і реактиви можуть впливати тільки на контрастність продукту на електрофореграмме, прояв артефактів в цих видах досліджень малоймовірно.
В даний час більшість популяцій в європейській частині Росії представлені штамами обох типів спарювання (табл. 6), серед них зустрічаються ізоляти з Ia і IIa типами мітохондріальної ДНК (інші типи mtDNA, що зустрічаються в світі, в Росії після 1993 року не виявлялися). Спектри ізоферментів пептідази представлені двома генотипами по локусу Pep1 (100/100, 92/92 і гетерозигота 92/100, причому генотип 92/92 зустрічається вкрай рідко (<0,3%)) і двома генотипами по локусу Pep 2 (100/100 , 112/112 і гетерозигота 100/112, причому генотип 112/112 зустрічається рідше 100/100, але теж досить часто).
Варіабельності спектра ізоферментів глюкозо-6 фосфат ізомерази після 1993 року (зникнення клональной лінії US-1) не відмічено, всі досліджені ізоляти мали генотип 100/100 (Elansky, Smirnov, 2002).
Третя група методів дозволяє отримати достатню групу незалежних маркерних ознак при високій відтворюваності. На сьогоднішній день до цієї групи можна віднести пробу RFLP-RG57, при використанні якої виходить 25-29 фрагментів ДНК різного розміру. Використовувати RFLP-RG57 можна як при аналізі вибірок, так і при складанні баз даних. Однак цей метод значно дорожчими за попередні, вимагає великих затрат часу, для його проведення необхідно досить велика кількість ДНК високого очищення. Тому дослідник змушений обмежувати обсяг тестованого матеріалу.
Розробка RFLP-RG57 на початку 90-х років минулого століття істотно активізувала популяційні дослідження збудника фітофторозу. Він став основою методу, заснованого на виділенні і аналізі «клональний ліній» (див. Нижче). Поряд з RFLP-RG57 для ідентифікації клональних ліній застосовують тип спаровування, фінгерпрінтінг ДНК (метод RFLP-RG57), спектри ізоферментів пептідази і глюкозо-6-фосфатізомерази і тип мітохондріальної ДНК. Завдяки йому було показано al., 1994), зміна старих популяцій новими (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), виявлені клональні лінії, що переважають у багатьох країнах світу. Дослідження російських штамів з використанням цього методу показало високий генотипический поліморфізм штамів Європейської частини і мономорфизм популяцій Азіатської і Далекосхідної частин Росії (Elansky et al, 2001). І зараз цей метод залишається основним при проведенні популяційних досліджень P. infestans. Однак широкому його поширенню перешкоджають досить висока вартість і трудомісткість у виконанні.
Іншим перспективним методом, широко рідко використовуваних в дослідженнях P. infestans, є аналіз мікросателітних повторів (SSR). В даний час цей метод щироко використовується для виділення клональних ліній. Для аналізу штамів широко використовувалися (і продовжують використовуватися) такі фенотипічні маркерні ознаки, як наявність генів вірулентності до сортам картоплі (Авдей, 1995, Іванюк та ін., 2002 Уланова та ін., 2003) і томата. До теперішнього часу гени вірулентності до сортам картоплі втратили свою цінність як маркерні ознаки для популяційних досліджень в зв'язку з появою максимального (або близького до нього) числа генів вірулентності у переважної більшості ізолятів. У той же час ген вірулентності Т1 до сортам томата, що несе відповідний ген Ph1, до сих пір успішно використовується в якості маркерного ознаки (Лаврова і др., 2003, Уланова і ін., 2003).
У багатьох роботах в якості маркерного ознаки використовується стійкість до фунгіцидів. Ця ознака небажано використовувати в популяційних дослідженнях у зв'язку з досить легким появою мутацій стійкості в клональних лініях після застосування металаксіл- (або мефеноксам-) містять фунгіцидів на поле. Наприклад, істотні відмінності за рівнем стійкості показані всередині клональной лінії Sib1 (Elansky et al., 2001).
Таким чином, кращими маркерними ознаками для створення банків даних та маркування штамів в колекціях є тип спаровування, спектр ізоферментів пептідази, тип мітохондріальної ДНК, RFLP-RG57, SSR. Для порівняння обмежених вибірок, при необхідності застосування максимального числа маркерних ознак, можна використовувати AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (табл. 5). Однак слід пам'ятати, що ці методи слабовоспроізводіми, і в кожному окремому експерименті (циклі ампліфікація електрофорез) необхідно використовувати кілька референтних ізолятів.
Таблиця 5. Порівняння різних методів дослідження штамів P. Infestans
критерій | ТС | Ізофер менти | МтДНК | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | оборот |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
кількість інформації | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Воспроізвоімость | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
можливість артефактів | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Вартість | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
трудомісткість | Н | Н | Н | В | НС * | НС * | Н | С | НС * |
Швидкість проведення аналізу ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Прим .: Н - низька, С - середня, В - висока; НС * - трудомісткість низька при використанні агарозного гелю або автоматичного
генотайпера, середня - при розгоні в поліакриламідному гелі з міченими праймерами,
** - не рахуючи витрат часу на нарощування міцелію для виділення ДНК.
структура популяцій
клональні лінії
У відсутності рекомбінації або при незначному її внесок в популяційної структуру популяція складається з деякого числа клонів, генетичні обміни між якими вкрай рідкісні.
У таких популяціях більш інформативно вивчення не частот окремих генів, а частот генотипів, що мають спільне походження (клональних ліній або clonal lineages) і розрізняються лише точковими мутаціями. Популяційні дослідження збудника фітофторозу і аналіз клональних ліній істотно прискорилися після появи методу RFLP-RG57 на початку 90-х років минулого століття. Поряд з RFLP-RG57, для ідентифікації клональних ліній використовують тип спаровування, спектри ізоферментів пептідази і глюкозо-6-фосфатізомерази, тип мітохондріальної ДНК. Характеристика найбільш часто зустрічаються клональних ліній наведена в таблиці 6.
Клон US-1 повсюдно домінував в популяціях до кінця 80-х років ХХ століття, після чого став замінюватися іншими клонами і зник з Європи і Північної Америки. Зараз він зустрічається на Далекому Сході (Філіппіни, Тайвань, Китай, Японія, Корея, Koh et al., 1994, Mosa et al, 1993), в Африці (Уганда, Кенія, Руанда, Goodwin et al, 1994, Vega-Sanchez et al., 2000; Ochwo et al., 2002) і в Південній Америці (Еквадор, Бразилія, Перу, Forbes et al., 1997, Goodwin et al, 1994). Не було ідентифіковано штамів, що належать до лінії US-1 тільки в Австралії. Мабуть, в Австралію ізоляти P. infestans потрапили з іншою хвилею міграції (Goodwin, 1997).
Клон US-6 мігрував з Північної Мексики до Каліфорнії в кінці 70-х років і викликав там епідемію на картоплі і томатах після 32 років відсутності хвороби. У зв'язку з високою агресивністю він витіснив клон US-1 і став домінувати на західному узбережжі США (Goodwin et al., 1995a).
Генотипи US-7 і US-8 були виявлені в США в 1992 р і вже в 1994 р широко поширилися в США і Канаді. Протягом одного польового сезону клон US-8 здатний майже повністю витіснити клон US-1 на картопляних ділянках, початково заражених обома клонами в рівній концентрації (Miller, Johnson, 2000).
Клони ВС-1 - ВС-4 були виявлені в Британській Колумбії у невеликого числа ізолятів Goodwin et al., 1995b). Клон US-11 широко поширився в США і витіснив US-1 на Тайвані. Клони JP-1 і ЄС-1, поряд з клоном US-1, поширені в Японії та Еквадорі, відповідно (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 - клон, що переважав в Росії на величезній території від Московської області до Сахаліну. У Московській області він був виявлений в 1993 р, причому деякі польові популяції складалися переважно з штамів цієї клональной лінії, високостійких до металаксилу. Після 1993 поширеність цього клону істотно знизилася. За Уралом в 1997-1998 роках SIB-1 зустрічався повсюдно за винятком Хабаровського краю (там поширений клон SIB-2). Просторове розділення клонів, що мають різні типи спаровування, виключає статевої процес на території Сибіру і Далекого Сходу. У Московській області, на відміну від Сибіру, популяція представлена безліччю клонів; майже кожен ізолят має унікальний мультілокусний генотип (Elansky et al., 2001., 2015). Ця різноманітність не можна пояснити тільки завезенням штамів гриба з різних районів світу з імпортованим насіннєвим матеріалом. Оскільки в популяції зустрічаються обидва типи спаровування, можливо, її різноманітність обумовлено також рекомбінацією. Так, в Британській Колумбії передбачається виникнення генотипів ВС-2, ВС-3 і ВС-4 внаслідок гібридизації клонів ВС-1 і US-6 (Goodwin et al., 1995b). Можливо, і в Московських популяціях зустрічаються гібридні штами. Наприклад, гетерозиготні по РЕР-локусу штами МО-4, МО-8 і МО-11 можуть бути гібридами між штамами МО-12, МО-21, МО-22, що мають тип спаровування А2 і гомозиготними по одній алелі РЕР-локусу і штамом МО-8, що має тип спаровування А1 і гомозиготних по інший аллели локусу. А якщо це так, і в сучасних популяціях P. infestans є тенденція до посилення ролі статевого процесу, то інформаційне значення аналізу мультілокусних клонів буде падати (Elansky et al., 2001., 2015).
Мінливість в клональних лініях
До 90-х років 20 століття в світі була широко поширена клональная лінія US-1. Більшість польових і регіональних популяцій складалися винятково з штамів з генотипом US-1. Однак при цьому спостерігалися і відмінності між ізолятів, викликані, найімовірніше, мутаційним процесом. Мутації відбувалися як в ядерній, так і в мітохондріальної ДНК і зачіпали в тому числі рівень стійкості до феніламідних препаратів і число генів вірулентності. Лінії, що відрізняються від вихідних генотипів мутаціями, позначаються додатковими цифрами після точки, наступного за назвою вихідного генотипу (наприклад, мутантна лінія US-1.1 клональной лінії US-1). Фінгерпрінтінгі ДНК лінії US-1.5 і US-1.6 містять додаткові лінії різного розміру (Goodwin et al., 1995a, 1995b); клональная лінія US-6.3 також відрізняється від US-6 однієї додаткової лінією (Goodwin, 1997, табл. 7).
При дослідженні мітохондріальної ДНК з'ясувалося, що в клональной лінії US-1 зустрічається тільки 1b тип мітохондріальної ДНК (Carter et al., 1990). Однак при дослідженні штамів цієї клональной лінії з Перу і Філіппін були відзначені ізоляти, типи мітохондріальної ДНК яких олічается від 1b наявністю вставок і делецій (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Таблиця 6. Мультілокусние генотипи деяких клональних ліній P. Infestans
Назва | Тип спарювання | Ферменти | фінгерпрінт ДНК | Тип MtDNA | |
GPI | PEP | ||||
США 1 | А1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 + 24 | Ib |
США 2 | А1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
США 3 | А1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 + 24 | - |
США 4 | А1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 + 24 | - |
США 5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
США 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 + 24 | IIб |
США 7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
США 8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
США 9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
США 10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
США 11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIб |
США 12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | - |
США 14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 + 24 | - |
США 15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
США 16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 + 24 | - |
США 17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 + 24 | - |
США 18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
США 19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 + 24 | IIa |
СІБ-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
СІБ-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
СІБ-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
Прим .: * - немає даних.
Таблиця 7. Мультілокусние генотипи і їх мутантні лінії
Назва | Тип спарювання | | Фінгерпрінт ДНК (RG57) | Примітки | |
GPI | ПЕП-1 | ||||
США 1 | А1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Вихідний генотип 1 |
США 1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Мутація в PEP |
США 1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Мутація в RG57 |
США 1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Мутація в RG57 |
США 1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Мутація в RG57 і РЕР |
США 1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Мутація в RG57 |
США 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Вихідний генотип 2 |
США 6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Мутація в PEP |
США 6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Мутація в RG57 |
США 6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Мутація в RG57 |
США 6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Мутація в RG57 і РЕР |
США 6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Мутація в RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Вихідний генотип 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Мутація в RG57 |
Також зустрічаються зміни в спектрах ізоферментів. Як правило, вони викликані розпадом початково гетерозиготного з цього ферменту організму на гомозиготні. У 1993 році на плодах томата нами було ідентифіковано штам з характерними для US-1 ознаками: фінгерпрінтінгом RG57, типом мітохондріальної ДНК і генотипом 86/100 по глюкозо-6-фосфатізомеразе, але він був гомозиготен (100/100) по першому локусу пептідази замість типовою для цієї клональной лінії гетерозиготи 92/100. Генотип цього штаму ми назвали МО-17 (табл. 6). Мутантні лінії US-1.1 і US-1.4 також відрізняються від US-1 мутаціями в першому локусі пептідази (табл. 7).
Мутації, що ведуть до змін числа генів вірулентності до сортам картоплі і томата зустрічаються досить часто. Вони були відзначені серед ізолятів клональной лінії US-1 в популяціях з Нідерландів (Drenth et al., 1994), Перу (Goodwin et al., 1995a), Польщі (Sujkowski et al., 1991), півночі Північної Америки (Goodwin et al ., 1995b). Відмінності в числі генів вірулентності до картоплі також були відзначені серед ізолятів клональних ліній US-7 і US-8 в Канаді і США (Goodwin et al., 1995a), серед ізолятів лінії SIB-1 в Азіатської частини Росії (Elansky et al, 2001. ).
Ізоляти, що мають сильні відмінності в рівнях стійкості до феніламідних препаратів, були ідентифіковані в моноклональних польових популяціях, всі штами в яких належали до клональной лінії Sib-1 (Elansky et al, 2001., табл. 1). Майже всі штами клональной лінії US-1 відрізняються високою чутливістю до металаксилу, однак високостійкі ізоляти цієї лінії були виділені на Філіппінах (Koh et al., 1994) і в Ірландії (Goodwin et al., 1996).
Сучасні популяції P. Infestans
Центральна Америка (Мексика)
Популяція P. infestans в Мексиці помітно відрізняється від інших світових популяцій, що пов'язано, в першу чергу, з її історичним становищем. Численні дослідження цієї популяції і родинних P. infestans видів скарби Phytophthora, а також місцевих видів роду Solanum, дозволили зробити висновок про те, що еволюція патогена в центральній частині Мексики відбувалася спільно з еволюцією рослин-господарів і була пов'язана зі статевою рекомбинацией (Grünwald, Flier , 2005). У популяції представлені обидва типи спаровування, причому в рівному співвідношенні, а присутність ооспор в грунті, на рослинах і бульбах картоплі і дикорослих споріднених видів Solanum підтверджує наявність в популяції статевого процесу (Fernández-Pavía et al., 2002). Нещодавно проведені дослідження долини Толука і її околиць (гаданий центр походження патогена) підтвердили високу генетичну різноманітність місцевої популяції P. infestans (134 мультілокусних генотипу у вибірці з 176 зразків) і наявність в регіоні декількох диференційованих субпопуляцій (Wang et al. 2017). Факторами, що сприяють такій диференціації, є просторове розділення субпопуляцій, характерне для гористій місцевості центральної Мексики, відмінності в умовах культивації та сортах картоплі, використовуваних в долинах і горах, а також наявність дикорослих клубненосного видів Solanum, здатних виступати в якості альтернативних господарів (Fry et al ., 2009).
Слід, однак, відзначити, що популяції P. Infestans в Північній Мексиці носять скоріше клональний характер і більше схожі на північноамериканські популяції, що, можливо, говорить про те, що саме нових генотипів (Fry et al., 2009).
Північна Америка
Північноамериканські популяції P. Infestans завжди відрізнялися дуже простою структурою і їх клональний характер був встановлений задовго до початку застосування Микросателлитная аналізу. Аж до 1987 р на території США і Канади домінувала клональная лінія US-1 (Goodwin et al., 1995). В середині 70-х рр, коли з'явилися фунгіциди на основі металаксил, цей клон почав витіснятися іншими, більш стійкими генотипами, які мігрували з Мексики (Goodwin et al., 1998). До кінця 90-х рр. генотип US-8 повністю витіснив в США генотип US-1 і став домінуючою клональной лінією на картоплі (Fry et al., 2009 року; Fry et al., 2015). Інша ситуація склалася з томатами, на яких постійно присутні кілька клональних ліній, причому їх склад рік від року змінювався (Fry et al., 2009).
У 2009 р в США вибухнула масштабна епідемія фітофторозу на томатах. Особливістю цієї пандемії стало практично одночасне її початок у багатьох місцях північно-східній частині США, причому вона виявилася пов'язана з масовими продажами зараженої розсади томатів у великих садових центрах (Fry et al., 2013). Втрати врожаю виявилися величезними. Микросателлитная аналіз уражених зразків дозволив встановити, що пандемічний штам належав до клональной лінії US-22 А2-типу спарювання. У 2009 р частка цього генотипу в американській популяції P. infestans досягла 80% (Fry et al., 2013). У наступні роки в популяції неухильно збільшувалася частка агресивних генотипів US-23 (переважно на томатах) і US-24 (на картоплі), однак після 2011 р частота виявлення US-24 істотно знизилася, і до теперішнього часу близько 90% популяції патогена в США представлено генотипом US-23 (Fry et al., 2015).
У Канаді, як і в США, в кінці 90-х рр. домінував генотип US-1 був витіснений US-8, домінуючі позиції якого залишалися непорушними до 2008 р У 2009-2010 рр. в Канаді трапилися серйозні епідемії фітофторозу, пов'язані з продажами зараженої розсади томата, але викликані вони були генотипами US-23 і US-8 (Kalischuk et al., 2012). Примітним виявилося чітке географічне розмежування цих генотипів: US-23 домінував в західних провінціях Канади (68%), в той час як US-8 панував в східних провінціях (83%). У наступні роки US-23 поширився в східні регіони, однак в цілому його частка в популяції дещо знизилася на тлі появи в країні генотипів US-22 і US-24 (Peters et al., 2014 року). До теперішнього часу US-23 зберігає домінуючі позиції на території всієї Канади; US-8 присутня в Британській Колумбії, а US-23 і US-24 - в Онтаріо (Peters 2017).
Таким чином, північноамериканські популяції P. infestans є, в-основному, клональні лінії. За останні 40 років число виявлених клональних генотипів досягло 24. Незважаючи на те, що в популяції присутні штами обох типів спарювання, ймовірність появи нових генотипів в результаті статевої рекомбінації залишається досить низькою. Проте, в останні 20 років було зафіксовано кілька випадків появи ефемерних рекомбінантних популяцій (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014 року), причому в одному випадку результатом схрещування став генотип US-11 , на довгі роки закріпився в Північній Америці (Gavino et al., 2000). До 2009 р зміни в структурі популяцій були пов'язані з появою нових, більш агресивних генотипів з їх подальшою міграцією і витісненням раніше домінували попередників. Те, що сталося в 2009-2010 рр. в США і Канаді епіфітотії вперше показали, що в епоху глобалізації спалаху хвороби можуть бути пов'язані і з активним поширенням нових генотипів при продажах зараженого садивного матеріалу.
Південна Америка
Аж до останнього часу дослідження американських популяцій P. infestans не відрізнялися ні регулярністю, ні масштабністю. Відомо, що структура цих популяцій досить проста і включає 1-5 клональних ліній на країну (Forbes et al., 1998). Так, у 1998 р року на картоплі були виявлені генотипи US-1 (Бразилія, Чилі) BR-1 (Бразилія, Болівія, Уругвай, Парагвай), EC-1 (Еквадор, Колумбія, Перу і Венесуела), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 і AR-5 (Аргентина), PE-3 і PE-7 (південна частина Перу). Тип спарювання А2 був присутній в Бразилії, Болівії і Аргентині і не виявлявся далі болівійсько-перуанського кордону в районі озера Тітікака, за якої в Андах домінував генотип ЄС-1 А1-типу. На томатах домінуючим генотипом у всій Південній Америці залишався US-1.
Ситуація більш-менш зберігалася і в 2000-х рр. Важливим моментом стало виявлення в Північних Андах на дикорослих родичів картоплі (S. brevifolium і S. tetrapetalum) нової клональной лінії EC-2 А2-типу (Oliva et al., 2010). Филогенетические дослідження показали, що ця лінія не є повністю ідентичною P. infestans, хоча і близькоспоріднених їй, в зв'язку з чим було запропоновано вважати її, а також ще одну лінію, ЄС-3, виділену з виростає в Андах томатного дерева S. betaceum, новим видом, який отримав назву P. andina; проте статус цього виду (самостійний вид або гібрид P. infestans c якийсь ще невідомої лінією) поки все ж залишається незрозумілим (Delgado et al., 2013).
В даний час все південноамериканські популяції P. infestans є клональний. Незважаючи на присутність обох типів спарювання рекомбінантних популяцій виявлено не було. На томатах повсюдно присутній генотип US-1, мабуть, витіснений з картоплі локальними штамами, точне походження яких поки невідомо. У Бразилії, Болівії і Уругваї присутній генотип BR-1; в Перу, поряд з US-1 і ЄС-1, існує кілька інших локальних генотипів. В Андах домінуючу позицію зберігає клональная лінія EC-1, взаємини якої з недавно виявленої P. andina поки залишаються невивченими. Єдиним «нестабільним» місцем, де за період 2003-2013 рр. відбувалися істотні зміни популяції, став Чилі (Acuña et al., 2012), де в 2004-2005 рр. популяція патогена стала характеризуватися стійкістю до металаксилу і новим гаплотипом мітохондріальної ДНК (Ia замість раніше присутнього Ib). З 2006 по 2011 рр. в популяції домінував генотип 21 (по SSR), частка якого досягала 90%, після чого пальма першості перейшла до генотипу 20, частота народження якого в наступні два роки утримувалася на рівні близько 67% (Acuña, 2015).
Європа
В історії Європи було, як мінімум, дві хвилі міграції P. infestans з Північної Америки: в XIX в. (HERB-1) і початку ХХ століття (US-1). Повсюдне поширення металаксілсодержащіх фунгіцидів в 70-х рр. призвело до витіснення домінував генотипу US-1 і заміні його новими генотипами. В результаті в більшості країн Західної Європи популяції патогена були представлені, в основному, декількома клональний лініями.
Використання Микросателлитная аналізу для аналізу популяцій патогена дозволило виявити серйозні зміни, що відбулися на території Західної Європи в 2005-2008 р У 2005 р в Великобританії була виявлена нова клональная лінія, названа 13_А2 (або "Blue 13") і характеризувалася типом спаровування А2 , високою агресивністю і стійкістю до феніламідів (Shaw et al., 2007). Цей же генотип був виявлений в зразках, зібраних в 2004 р в Нідерландах і Північній Франції, що дало підстави припустити його міграцію в Великобританію з території континентальної Європи, можливо, з насіннєвою картоплею (Cooke et al., 2007). Дослідження генома представників цієї клональной лінії показало високу ступінь поліморфізму його послідовності (до 2016 р число його субклональних варіацій досягло 340) і значний ступінь варіації рівня експресії генів, в т.ч. генів-ефекторів, в процесі інфікування рослин (Cooke et al., 2012; Cooke 2017). Ці особливості, поряд зі збільшеною тривалістю біотрофной фази, могли стати причиною підвищеної агресивності 13_А2 і його здатності вражати навіть стійкі до фітофторозу сорти картоплі.
У наступні кілька років генотип стрімко поширився по країнах Північно-Західної Європи (Великобританія, Ірландія, Франція, Бельгія, Нідерланди, Німеччина) з одночасним витісненням раніше домінували там генотипів 1_А1, 2_А1, 8_А1 (Montarry et al., 2010 року; Gisi et al. , 2011 року; Van den Bosch et al., 2011 року; Cooke, 2015; Cooke 2017). За даними сайту www.euroblight.net, частка 13_А2 в популяціях згаданих країн сягала 60-80% і вище; присутність цього генотипу було також зафіксовано в деяких країнах Східної і Південної Європи. Однак в 2009-2012 рр. 13_А2 втратив домінуючі позиції в Великобританії і Франції, поступившись лінії 6_А1 (в Ірландії - 8_А1), а в Нідерландах і Бельгії був частково заміщений генотипами 1_А1, 6_А1 і 33_А2 (Cooke et al., 2012; Cooke 2017; Stellingwerf 2017).
До теперішнього часу близько 70% західноєвропейської популяції P. infestans є моноклональній. Згідно з даними сайту www.euroblight.net, домінуючими генотипами в країнах Північно-західної Європи (Великобританія, Франція,
Нідерланди, Бельгія) залишаються, приблизно в рівному співвідношенні, 13_А2 і 6_А1, причому останній практично не зустрічається за межами цього регіону (за винятком Ірландії), але налічує вже не менше 58 субклонов (Cooke 2017). Варіації 13_А2 в помітній кількості присутні в Німеччині, а також спорадично відзначаються в країнах Центральної і Південної Європи. Генотип 1_А1 становить істотну частину популяцій Бельгії та частково Нідерландів і Франції. Генотип 8_А1 стабілізувався в європейській популяції на рівні 3-6%, за винятком Ірландії, де він зберігає лідируючі позиції і розділився на два субклона (Stellingwerf 2017). Нарешті, в 2016 р відзначено збільшення частоти народження нових генотипів 36_А2 і 37_А2, вперше зареєстрованих в 2013-2014 рр .; до теперішнього часу ці генотипи зустрічаються на території Нідерландів і Бельгії і частково Франції та Німеччини, а також в південній частині Великобританії (Сooke 2017). Приблизно 20-30% західноєвропейської популяції щорічно представлено унікальними генотипами.
На відміну від Західної Європи, до моменту появи генотипу 13_А2, популяції Північної Європи (Швеція, Норвегія, Данія, Фінляндія) були представлені не клональний лініями, а великою кількістю унікальних генотипів (Brurberg et al.,
2011). В період активного поширення 13_А2 по країнах Західної Європи присутність цього генотипу в Скандинавії не було відзначено аж до 2011 року, коли він вперше був виявлений в Північній Ютландії (Данія), де вирощують, в основному, промислові сорти картоплі з активним використанням металаксил-містять фунгіцидів (Nielsen et al., 2014 року). Згідно з даними сайту www.euroblight.net, генотип 13_А2 був також виявлений в декількох зразках з Норвегії і Данії в 2014 р і в декількох норвезьких зразках в 2016 р .; крім того, в 2013 р в Фінляндії було відзначено присутність в незначній кількості генотипу 6_А1. Основною причиною невдачі 13_А2 і інших клональних ліній в завоюванні Скандинавії вважаються кліматичні відмінності цього регіону від країн Західної Європи.
Крім того, що прохолодне літо і холодна зима сприяють виживанню не так вегетативного міцелію, скільки ооспор (Sjöholm et al., 2013), замерзання грунту в зимовий період (чого зазвичай не відбувається в більш теплих країнах Західної Європи) сприяє синхронізації проростання ооспор і посадки картоплі, що підсилює їх роль як джерела первинної інфекції (Brurberg et al., 2011). Слід також зазначити, що в умовах півночі розвиток інфекції з ооспор випереджає розвиток бульбової інфекції, що, в кінцевому підсумку, запобігає домінування нехай навіть більш агресивних, але пізніше розвинулися клональних ліній (Yuen, 2012). Структура найбільш досліджених популяцій P. infestans в країнах Східної Європи (Польща, Прибалтика) вельми схожа з такою в Скандинавії.
Тут також присутні обидва типи спаровування і переважна більшість генотипів, визначених за допомогою SSR аналізу, є унікальними (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Як і в Північній Європі, поширення клональних ліній (в першу чергу генотипу 13_А2) практично не торкнулося локальні популяції патогена, що зберігають високий рівень різноманітності з відсутністю виражених домінантних ліній.
Присутність 13_А2 епізодично відзначається на полях з комерційними сортами картоплі. У Росії ситуація складається аналогічним чином. Микросателлитная аналіз ізолятів P. infestans, зібраних в 2008-2011 рр. в 10 різних регіонах європейської частини Росії, показав високий ступінь генотипического різноманітності і повна відсутність збігів з європейськими клональний лініями (Statsyuk et al., 2014 року). Проведене через кілька років дослідження зразків P. infestans, зібраних в Ленінградській області в 2013-2014 рр., Показало істотні відмінності між ними і виявленими в попередньому дослідженні генотипами з цієї області. В обох дослідженнях західноєвропейських генотипів виявлено не було (Beketova et al., 2014; Кузнєцова та ін., 2016).
Висока генетична різноманітність східно-європейських популяцій P. infestans і відсутність в них домінуючих клональних ліній може бути пов'язано з декількома причинами. По-перше, як і в Північній Європі, кліматичні умови розглянутих країн сприяють формуванню ооспор як первинне джерело інфекції (Уланова та ін., 2010 року; Chmielarz et al., 2014 року). По-друге, істотна частка картоплі, вироблена в даних країнах, вирощується в дрібних приватних господарствах, часто оточених лісами або іншими перешкодами для вільного переміщення інфекційного матеріалу (Chmielarz et al., 2014 року). Як правило, картопля, вирощений в таких умовах, практично не обробляється хімічними препаратами, а вибір сортів ґрунтується на їх фітофтороустойчівості, тобто відсутня селективне тиск по агресивності і стійкості до металаксилу, що позбавляє стійкі генотипи, такі як 13_А2, переваги перед іншими генотипами (Chmielarz et al., 2014 року). Нарешті, через невеликих розмірів земельних ділянок, їх власники зазвичай не практикують сівозміну, роками вирощуючи картоплю на одному і тому ж місці, що сприяє накопиченню генетично різноманітного інокулюму (Runno-Paurson et al., 2016 року; Еланский, 2015; Elansky et al ., 2015).
Азія
Аж до останнього часу структура популяцій P. infestans в Азії залишалася відносно маловивченою. Було відомо, що вона представлена переважно клональний лініями, а вплив статевої рекомбінації на появу нових генотипів досить мало. Так, наприклад, в 1997-1998 рр. в азіатській частині Росії (Сибір і Далекий Схід) популяція патогена була представлена лише трьома генотипами з переважанням генотипу SIB-1 (Elansky et al., 2001). Присутність клональних ліній патогена було показано в таких країнах як Китай, Японія, Корея, Філіппіни і Тайвань (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Домінувала на великій території Азії клональная лінія US-1 в кінці 90-х - початку 2000-х рр. практично повсюдно початку витіснятися іншими генотипами, які, в свою чергу, поступалися місцем новим. У більшості випадків зміни в структурі і складі популяцій в азіатських країнах були пов'язані з міграцією нових генотипів ззовні. Так, в Японії за винятком генотипу JP-3, всі інші японські генотипи, що з'явилися після US-1 (JP-1, JP-2, JP-3), мають більш-менш доведене зовнішнє походження (Akino et al., 2011) . У Китаї на цей момент існує три основних популяції патогена, що мають чітке географічне розділення; перетікання генів між цими популяціями відсутній або дуже слабкий (Guo et al., 2010 року; Li et al., 2013b). Генотип 13_А2 з'явився на території Китаю в його південних провінціях (Юннань і Сичуань) в 2005-2007 рр., А в 2012-1014 рр. був також помічений на північному сході країни (Li et al., 2013b). В Індії 13_А2 з'явився імовірно в той же час, що і в Китаї, швидше за все, із зараженим насіннєвим картоплею (Chowdappa et al., 2015), і в 2009-2010 рр. викликав серйозну епіфітотії фітофторозу на томаті на півдні країни, після чого поширився на картоплю і в 2014 р став причиною спалаху фітофторозу в Західній Бенгалії, що призвела до розорення і самогубств багатьох місцевих фермерів (Fry, 2016).
Африка
Аж до 2008-2010 рр. систематичні дослідження P. infestans в країнах Африки не проводилися. На даний момент африканські популяції P. infestans можуть бути розділені на дві групи, причому цей поділ чітко асоційоване з фактом імпорту насіннєвої картоплі з Європи.
У Північній Африці, активно імпортує насіннєву картоплю з Європи, практично у всіх регіонах широко представлений тип спаровування А2, що забезпечує теоретичну можливість появи нових генотипів в результаті статевої рекомбінації (Corbière et al., 2010 року; Rekad et al. 2017). Крім того, в Алжирі відзначається присутність генотипів 13_А2, 2_А1 і 23_А1 з вираженим домінуванням першого з них, а також поступове зниження до повного зникнення частки унікальних генотипів (Rekad et al. 2017). На відміну від решти регіону, в Тунісі (за винятком північного сходу країни) популяція патогена представлена переважно типом спаровування А1 (Harbaoui et al., 2014 року).
Домінуючою тут є клональная лінія NA-01. В цілому частка клональних ліній в популяції становить лише 43%. У Східній і Південній Африці, де обсяги імпорту насіннєвого матеріалу зникаюче малі (Fry et al., 2009), P. infestans представлена лише двома клональний лініями А1-типу, US-1 і KE-1, причому остання активно витісняє першу на картоплі ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). До теперішнього часу обидва цих генотипу мають помітну кількість субклональних варіацій.
Австралія
Перше повідомлення про прояв фітофторозу на картоплі в Австралії датується 1907 року, а перша епіфітотія, імовірно викликана сильними дощами в літні місяці, трапилася в 1909-1911 рр. (Drenth et al., 2002). В цілому, однак, фітофтороз не має істотного економічного значення для країни. Спорадичні спалахи фітофторозу, спровоковані погодними умовами, що забезпечують підвищену вологість, трапляються не частіше разу на 5-7 років і локалізовані переважно в північній Тасманії і центральній частині провінції Вікторія. У зв'язку з вищевикладеним, публікації, присвячені вивченню структури австралійської популяції P. infestans, практично відсутні. Остання доступна інформація відноситься до 1998-2000 рр. (Drenth et al., 2002). Згідно з даними авторів, популяція штату Вікторія представляла собою клональную лінію US-1.3, що побічно підтверджувало міграцію цього генотипу з США. Тасманійські ж зразки були виділені в тип AU-3, відмінний від генотипів, які були присутні на той момент в інших частинах світу.
Особливості розвитку фітофторозу в Росії
У Європі в якості первинного інокулюму на картоплі розглядають інфекцію, привнесену з хворими насіннєвими бульбами, що перезимували в грунті ооспори, а також зооспорангії, принесені вітром з рослин, що виросли з перезимували бульб на торішніх полях ( «волонтерние» рослини), або на купах отбракованних при закладці на зберігання бульб. З них найбільш небезпечним джерелом інфекції вважаються рослини, які виросли на купах отбракованних бульб, тому що там кількість пророслих бульб часто значно, і зооспорангії можуть з них розноситися на великі відстані. Інші джерела (ооспори, «волонтерние» рослини) не настільки небезпечні, тому що рослини не прийнято вирощувати на одних і тих же полях частіше, ніж один раз в 3-4 року. Інфекція від хворих насіннєвих бульб також мінімальна у зв'язку з хорошою системою контролю якості насіннєвого матеріалу.
В цілому, кількість інокулюму в європейських популяціях обмежена, в зв'язку з чим наростання епідемії відбувається досить повільно і піддається успішному контролю за допомогою хімічних фунгіцидних препаратів. Основним завданням в європейських умовах стає боротьба з інфекцією в тій фазі, коли починається масовий розліт зооспорангіїв з уражених рослин.
У Росії ситуація кардинально інша. Велика частина врожаю картоплі і томата вирощується на невеликих приватних городах; захисні заходи на них або взагалі не проводяться, або фунгіцидні обробки проводяться в недостатньому числі і починаються вже після появи фітофторозу на бадиллі. В результаті приватні городи виступають як основне джерело інфекції, з них зооспорангії вітром переносяться на комерційні посадки. Це підтверджується нашими прямими спостереженнями в Московській, Брянській, Костромської, Рязанської областях: ураження рослин на приватних городах спостерігається ще до початку обробок фунгіцидами комерційних посадок. Згодом епідемія на великих полях стримується застосуванням фунгіцидних препаратів, в той час як на приватних городах спостерігається бурхливий розвиток фітофторозу.
У разі неправильних або «бюджетних» обробок комерційних посадок осередки фітофторозу з'являються і на полях; в подальшому вони активно розвиваються, захоплюючи все більші площі (Еланский, 2015). Інфекція, що розвивається на приватних городах, робить істотний вплив на епідемію на комерційних полях. У всіх бульбоносних регіонах Росії площа, зайнята картоплею на приватних городах, в рази перевершує сумарну площу полів великих виробників. В таких умовах приватні городи можна розглядати як глобальний ресурс інокулюму для комерційних полів. Спробуємо виявити ті властивості, які характерні для генотипів штамів на приватних городах.
Посадка не пройшов насіннєвий і карантинний контроль продовольчої картоплі, насіння томата, отриманих від сумнівних зарубіжних виробників, багаторічна вирощування картоплі та томату на одних і тих же площах, неправильні обробки фунгіцидами або їх повна відсутність призводять до тяжких епіфітотії в приватному секторі, наслідком яких є вільний схрещування, гібридизація і освіту ооспор на приватних городах. В результаті спостерігається дуже високий генотипическое різноманітність патгена, коли практично кожен штам є унікальним за своїм генотипом (Elansky et al., 2001., 2015). Посадка насіннєвої картоплі різного генетичного походження робить малоймовірною появу клональних ліній, спеціалізованих до поразки будь-якого сорту. Штами, селектірующіеся в подібному випадку, відрізняються універсальністю по відношенню до уражається сортам, більшість з них мають близьке до максимального число генів вірулентності. Це сильно відрізняється від системи «клональних ліній», типових для великих полів сільгоспорганізацій з правильно поставленої системою захисту від фітофторозу. «Клональний лінії» (коли всі штами збудника фітофторозу на поле представлені одним або декількома генотипами) повсюдно поширені в країнах, де картоплярство ведеться виключно великими господарствами: США, Нідерланди, Данія та ін. В Англії, Ірландії, Польщі, де також традиційно поширене присадибне картоплярство, теж відзначається більш висока генотипическое різноманітність на приватних городах. «Клональний лінії» в кінці 20 століття були широко поширені в Азіатської і Далекосхідної частинах Росії (Elansky et al., 2001), що, мабуть, пов'язано з використанням для посадки виключно картоплі власного виробництва одних і тих же сортів. Останнім часом ситуація в цих регіонах також почала змінюватися в бік підвищення генотипического різноманітності популяцій.
Відсутність інтенсивних обробок фунгіцидними препаратами має й іншу, прямий наслідок - на городах не відбувається накопичення стійких штамів. Дійсно, наші результати показують, що на приватних городах значно рідше, ніж на комерційних посадках, виявляються стійкі до металаксилу штами.
Типове для приватних городів близьке сусідство посадок картоплі та томату полегшує міграцію штамів між цими культурами, в результаті чого в останнє десятиліття серед штамів, що виділяються з картоплі, причиною підвищення кількості штамів, що несуть ген стійкості до сортам вішневідние томата (Т1), раніше характерний тільки для « томатних »штамів. Штами з геном Т1 в більшості випадків виявляються високоагресивних по відношенню як до картоплі, так і до томату.
В останні роки фітофтороз на томаті став проявлятися в багатьох випадках раніше, ніж на картоплі. Джерелом зараження розсади томата можуть бути ооспори, що знаходяться в грунті, або ооспори, присутні в насінні томата, або які прилипли до них (Rubin et al., 2001). В останні 15 років в магазинах з'явилася велика кількість недорогих фасованих насіння, переважно імпортного виробництва, на використання яких і перейшла більша частина дрібних виробників. З насінням можуть приходити штами з генотипами, типовими для регіонів їх вирощування. Надалі ці генотипи включаються в статевий процес на приватних городах, що веде до появи зовсім нових генотипів.
Таким чином, можна констатувати, що приватні городи є глобальним «плавильним казаном», в якому в результаті обміну генетичним матеріалом переробляються існуючі генотипи і з'являються абсолютно нові. При цьому їх селекція проходить в умовах, сильно відрізняються від створюваних для картоплі в великих господарствах: відсутність фунгіцидної преса, сортовий виравненності посадок, переважання рослин, уражених різними формами вірусної і бактерійної інфекції, сусідство з томатами і дикими пасльоновими, активне схрещування і ооспорообразованіе, можливість для ооспор виступати джерелом інфекції на наступний рік.
Все це призводить до дуже високого генотипну різноманітність присадибних популяцій. В умовах епіфітотії на городах відбувається дуже швидке поширення фітофторозу і викид величезних кількостей суперечка, перелітають на прилеглі комерційні посадки. Однак, потрапивши на комерційні поля з правильною системою агротехніки і хімзахисту, які прилетіли суперечки практично не мають можливості ініціювати епіфітотії на поле, що пов'язано з відсутністю стійких до фунгіцидів і спеціалізованих до вирощуємо сорту клональних ліній.
Іншим джерелом первинного інокулюму можуть бути уражені бульби, що потрапили в комерційні посадки з насіннєвим матеріалом. Ці бульби були вирощені, як правило, на полях з хорошою агротехнікою та інтенсивної хімзахистом. Генотипи ізолятів, які вразили бульби, адаптовані до розвитку на своєму сорті. Ці штами значно небезпечніше для комерційних посадок ніж інокулюм, що відбувається з приватних городів. На користь цього припущення говорять і результати наших досліджень. Популяції, виділені з великих полів з правильно проведеної хімзахистом і хорошою агротехнікою не відрізняються високим генотипів різноманітністю. Часто це кілька клональних ліній, що відрізняються високою агресивністю.
Штами з комерційного насіннєвого матеріалу можуть потрапити в популяції на городах і включитися в процеси, що йдуть в них. Однак в умовах городу їх конкурентоспроможність буде значно нижче, ніж на комерційному полі, і незабаром вони перестануть існувати у вигляді клональной лінії, але їх гени можуть бути використані в «городньої» популяції.
Інфекція, що розвивається на «волонтерних» рослинах і на купах отбракованних при збиранні бульб для Росії не настільки актуальна, тому що в основних бульбоносних регіонах Росії спостерігається глибоке зимовий промерзання грунту, і рослини з перезимували в грунті бульб розвиваються рідко. Більш того, як показують наші експерименти, збудник фітофторозу не виживає при негативних температурах навіть на зберегли життєздатність бульбах. У аридной зоні, де практикується вирощування ранньої картоплі, фітофтороз зустрічається досить рідко через сухого і жаркого сезону вегетації.
Таким чином, в даний час ми спостерігаємо поділ популяцій P. infestans на «польові» і «городні». Однак останніми роками спостерігаються процеси, що ведуть до зближення і взаємопроникнення генотипів з цих популяцій.
Серед них можна відзначити загальне підвищення грамотності дрібних виробників, поява доступних дрібних фасовок насіннєвої картоплі, поширення фунгіцидних препаратів в дрібній фасовці, втрата населенням страху перед «хімією».
Виникають ситуації, коли завдяки активній діяльності одного постачальника цілі селища виявляються засадженими насіннєвими бульбами одного сорту і забезпечені дрібній фасовці одних і тих же пестицидів. Цілком можна припустити, що картопля того ж сорту виявиться і на комерційних посадках поблизу.
З іншого боку, деякі торгують пестицидами компанії просувають «бюджетні» схеми хімобработок. У цьому випадку кількість рекомендованих обробок знижується і пропонуються найдешевші фунгіциди, причому основний акцент робиться не на недопущення розвитку фітофторозу аж до скошування бадилля, а на деяку затримку епіфітотії з метою збільшення виходу врожаю. Такі схеми економічно обгрунтовані при вирощуванні продовольчої картоплі з низькосортної насіннєвого матеріалу, коли про отримання високого врожаю мова в принципі не йде. Однак в цьому випадку, на відміну від городніх популяцій, вирівняний генетичний фон картоплі сприяє відбору специфічних фізіологічних рас, дуже небезпечним для даного сорту.
В цілому, тенденції до зближення «городнього» і «польового» способів виробництва картоплі представляються нам досить небезпечними. Для запобігання їх негативних наслідків як в присадибній, так і в комерційному секторі буде потрібно як контроль сортименту насіннєвої картоплі і асортименту фунгіцидів, пропонованих приватникам в дрібній фасовці, так і відстеження схем захисту картоплі та застосування фунгіцидних препаратів в комерційному секторі.
На ділянках приватного сектора спостерігається інтенсивний розвиток не тільки фітофторозу, а й альтернаріозу. Більшість власників ЛПХ спеціальних заходів для захисту від альтернаріозу не роблять, приймаючи розвиток альтернаріозу за природне в'янення бадилля або розвиток фітофторозу. Тому при масовому розвитку альтернаріозу на сприйнятливих сортах присадибні ділянки можуть служити джерелом інокулюму і для комерційних посадок.
механізми мінливості
мутаційний процес
Оскільки виникнення мутацій - випадковий процес, що протікає з низькою частотою, виникнення мутацій за будь-якою локусу залежить від частоти мутації цього локусу і чисельності популяції. При вивченні частоти мутацій штамів P. infestans зазвичай визначають чисельність колоній, які виросли на селективних поживних середовищах після обробки хімічними або фізичними мутагенами. Як видно з представлених в таблиці 8 даних, частота мутації одного і того ж штаму за різними локусами може відрізнятися на кілька порядків. Висока частота мутацій стійкості до металаксилу може бути однією з причин накопичення резистентних до нього штамів в природі.
Частота спонтанних або індукованих мутацій, обчислена на підставі лабораторних дослідів, не завжди відповідає процесам, що відбуваються в природних популяціях, з наступних причин:
1. При несинхронних ядерних розподілах неможливо оцінити частоту мутацій, що припадають на одну ядерну генерацію. Тому більшість експериментів дає інформацію лише безпосередньо про частоту мутацій, не роблячи відмінностей між двома мутаційними подіями і однією подією, наступним за митозом.
2. Однокрокові мутації зазвичай знижують збалансованість генома, тому поряд з придбанням нового властивості знижується загальна пристосованість організму. Більшість експериментально отриманих мутацій має знижену агресивність і не фіксується в природних популяціях. Так, коефіцієнт кореляції між ступенем стійкості мутантів P. infestans до феніламідних фунгіцидів і швидкістю зростання на штучному середовищі склав в середньому (-0,62), а стійкістю до фунгіцидів і агресивністю на листках картоплі (-0,65) (Деревягина і ін. , 1993), що свідчить про низьку пристосованості мутантів. Мутації стійкості до диметоморф також супроводжувалися різким зниженням життєздатності (Bagirova et al., 2001).
3. Більшість спонтанних і індукованих мутацій рецесивні і не проявляються фенотипно в експериментах, але становлять прихований резерв мінливості природних популяцій. Мутантні штами, виділені в лабораторних дослідах, несуть домінантні або полудомінантние мутації (Куліш, Дьяков, 1979). Мабуть, диплоїдний ядер пояснюються невдалі спроби отримати під впливом УФ-опромінення мутанти, вірулентні на раніше стійких сортах (McKee, 1969). За розрахунками автора, такі мутації можуть виникати з частотою менше 1: 500000. Перехід рецесивних мутацій в гомозиготное, фенотипически виражене стан може статися внаслідок статевої або безстатевою рекомбінації (див. Нижче). Однак навіть в такому випадку мутація може маскуватися домінантними алелями ядер дикого типу в ценотичних (багатоядерному) міцелії і фенотипически фіксуватися тільки при утворенні одноядерних зооспор.
Таблиця 8. Частота мутацій P. infestans до ростінгібірующім речовин під дією нітрозометілмочевіни (Долгова, Дьяков, 1986; Bagirova et al., 2001)
з'єднання | частота мутацій |
окситетрациклін | 6,9 х 10-8 |
Бластіцідін S | 7,2 х 10-8 |
Cтрептоміцін | 8,3 х10-8 |
трихотецин | 1,8 х 10-8 |
циклогексимід | 2,1 х 10-8 |
Дакон | <4 x 10-8 |
диметоморф | 6,3 х 10-7 |
металаксил | 6,9 х 10-6 |
Розміри популяцій також відіграють вирішальну роль в появі спонтанних мутацій. У дуже великих популяціях, в яких чисельність клітин N> 1 / a, де а - швидкість мутації, мутація перестає бути випадковим явищем (Квітко, 1974).
Розрахунки показують, що при середній зараженості картопляного поля (35 плям на одній рослині) на одному гектарі щодня формується 8х1012 суперечка (Дьяков, Супрун, 1984). Мабуть, в таких популяціях зустрічаються усі дозволені типом обміну мутації по кожному локусу. Навіть рідкісна мутація, що виникає з частотою 10-9, буде знайдена тисячею особин з мільйонів, що мешкають на одному гектарі картопляного поля. Для мутацій, що виникають з більш високою частотою (наприклад, 10-6), в такій популяції можуть щодня виникати різноманітні парні мутації (одночасно за двома локусами), тобто мутаційний процес замінить рекомбінацію.
міграції
Для P. infestans відомі два основних типи міграції: на близькі відстані (в межах картопляного поля або сусідніх полів) шляхом розносу зооспорангіїв повітряними струмами або дощовими бризками, і на далекі відстані - з посадочними бульбами або перевозяться плодами томата. Перший спосіб забезпечує розширення вогнища хвороби, другий - створення нових вогнищ в місцях, віддалених від первинного.
Поширення інфекції з бульбами і плодами томата не тільки сприяє виникненню хвороби в нових місцях, але і є основним джерелом генетичної різноманітності популяцій. У Московській області вирощується картопля, привезений з різних регіонів Росії і Західної Європи. Плоди томата привозяться з південних регіонів Росії (Астраханська обл., Краснодарський край, Північний Кавказ). Насіння томату, які теж можуть бути джерелами інфекції (Rubin et al., 2001), також привозяться з південних регіонів Росії, Китаю, держав Європи та інших країн.
За розрахунками Е. Майра (1974) генетичні зміни в локальній популяції, обумовлені мутаціями, рідко перевищують 10-5 на локус, в той час як у відкритих популяціях обмін внаслідок зустрічного потоку генів становить не менше 10-3 - 10-4.
Міграцією в заражених бульбах обумовлено потрапляння P. infestans в Європу, поширення по всіх регіонах світу, де вирощують картоплю; ними викликані найсерйозніші популяційні перебудови. Фітофтороз на картоплі з'явився на території Російської імперії майже одночасно з його появою в Західній Європі.
Оскільки хвороба вперше була відзначена в 1846-1847 рр в Прибалтиці і тільки в наступні роки поширилася в Білорусії і Північно-Західних районах Росії, її західноєвропейське походження очевидно. Не настільки очевидний перший джерело фітофторозу в Старому Світі. Розвиваємо Фраєм з співавторами (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) гіпотеза припускає, що паразит потрапив з Мексики спочатку в Північну Америку, де поширився по посівам, а потім був перевезений в Західну Європу (рис. 7).
В результаті повторного дрейфу (подвійного ефекту «пляшкового горлечка») до Європи потрапили поодинокі клони, потомство яких викликало пандемію на всій території Старого Світу, де вирощують картоплю. Як докази цієї гіпотези автори наводять, по-перше, повсюдну зустрічальність тільки одного типу спарювання (А1) і, по-друге, однорідність генотипів досліджених штамів з різних регіонів (всі вони по молекулярним маркерами, що включає 2 ізоферментних локусу, патерни фінгерпрінтінга ДНК і структуру мітохондріальної ДНК, ідентичні, і відповідають описаному в США клону US-1). Однак деякі дані змушують сумніватися принаймні в деяких положеннях викладеної гіпотези. Аналіз мітохондріальної ДНК P. infestans, виділеної з гербарних зразків картоплі, заражених в роки першої епіфітотії 40-х років XIX ст, показав, що за структурою мітохондріальної ДНК вони відрізняються від клону US-1, який, отже, був, по крайней мере, не єдиним джерел інфекції в Європі (Ristaino et al, 2001).
Ситуація з фітофторозом знову погіршилася в 80-і роки XX століття. Відбулися такі зміни:
1) Збільшилася середня агресивність популяції, що призвело, зокрема, до широкого поширення найбільш шкідливою форми фітофторозу - ураження черешків і стебел.
2) Стався зсув часу появи фітофторозу на картоплі - з кінця липня на початок липня і навіть на кінець червня.
3) Став повсюдно зустрічатися тип спаровування А2, відсутній раніше в Старому Світі.
Змінам передували дві події: масове застосування нового фунгіциду металаксил (Schwinn, Staub, 1980) і вихід Мексики в світові експортери картоплі (Niederhauser, 1993). Відповідно до цього були висунуті дві причини популяційних змін - конверсія типу спарювання під впливом металаксил (Ko, 1994) і масовий занесення нових штамів із зараженими бульбами з Мексики (Fry, Goodwin, 1995). Хоча взаємоперетворення типів спарювання під впливом металаксил були отримані не тільки Ко, а й в роботах, виконаних у лабораторії МДУ (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), друга гіпотеза краще. Поряд з появою другого типу спарювання відбулися серйозні зміни в генотипах російських штамів P. infestans, в тому числі в нейтральних генах (ізоферментних і RFLP-локусах), а також в структурі мітохондріальної ДНК. Комплекс цих змін не можна пояснити дією металаксил, швидше за стався масове завезення нових штамів з Мексики, які, будучи більш агресивними (Kato et al., 1997), витіснили старі штами (US-1), ставши домінуючими в популяціях. Зміна складу європейських популяцій сталося в дуже короткий термін - з 1980 по 1985 рр (Fry et al., 1992). На території колишнього СРСР «нові штами» були виявлені в зборах з Естонії 1985 р, тобто раніше, ніж в Польщі і Німеччині (Goodwin et al., 1994). Останній раз «старий штам US-1» в Росії був виділений з ураженого томата в Московській області в 1993 р (Долгова та ін., 1997). Також і у Франції «старі» штами зустрічалися в посадках томатів до початку 90-х років, тобто після того, як на картоплі вони давно зникли (Leberton, Andrivon, 1998). Зміни штамів P. infestans торкнулися багато ознак, в тому числі що мають важливе практичне значення, і посилили шкідливість фітофторозу.
статева рекомбінація
Для того, щоб статева рекомбінація могла б робити внесок в мінливість, необхідно, по-перше, присутність в популяції двох типів спарювання в співвідношенні, близькому до 1: 1, і, по-друге, наявність вихідної варіабельності популяції.
Співвідношення типів спарювання сильно варіює в різних популяціях і навіть в різні роки в одній популяції (табл. 9,10). Причини таких змін частот типів спарювання в популяціях (як, наприклад, в Росії або в Ізраїлі на початку 90-х рр минулого століття) невідомі, але вважають, що це пов'язано із завезенням більш конкурентоспроможних клонів (Cohen, 2002).
Деякі непрямі дані свідчать про протікання статевого процесу в окремі роки і в окремих регіонах:
1) Дослідження популяцій з Московської області показало, що в 13 популяціях, в яких частка типу спарювання А2 була менше 10%, загальне генетичну різноманітність, обчислене за трьома ізоферментних локусам, склало 0,08, а в 14 популяціях, в яких частка А2 перевищувала 30%, генетична різноманітність було вдвічі вище (0,15) (Еланский і ін., 1999). Таким чином, чим вище ймовірність статевого процесу, тим більше генетичну різноманітність популяції.
2) Зв'язок між співвідношенням типів спарювання в популяціях і інтенсивністю освіти ооспор спостерігали в Ізраїлі (Cohen et al., 1997) і в Голландії
(Flier et al., 2004). Наші дослідження показали, що в популяціях, в яких ізоляти з типом спаровування А2 становили 62, 17, 9 і 6%, ооспори виявлені в 78, 50, 30 і 15% проаналізованих листочків картоплі (мають 2 і більше плям) відповідно.
Зразки з 2 і більше плямами значно частіше містили ооспори, ніж зразки з 1 плямою (32 і 14% зразків відповідно) (Апришко і ін., 2004).
Ооспори значно частіше зустрічалися в листі середнього і нижнього ярусу рослини картоплі (Мица та ін., 2015; Elansky et al., 2016).
3) Залежно від регіону були виявлені унікальні генотипи, виникнення яких пов'язують зі статевою рекомбинацией. Так, в Польщі в 1989 р і у Франції в 1990 р були виявлені штами, гомозиготні по локусу глюкозо-6
фосфатізомерази (GPI 90/90). Оскільки раніше протягом 10 років зустрічалися тільки гетерозиготи 90/100, гомозиготность приписують статевої рекомбінації (Sujkowski et al., 1994). У Колумбії (США) звичайні ізоляти, що поєднують А2 з GPI 100/110 і А1 з GPI 100/100, проте в кінці сезону 1994 року (16 серпня і 9 вересня) були виявлені штами, що мають рекомбінантні генотипи (А1 GPI 100/110 і A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) У деяких популяціях з Польщі (Sujkowski et al., 1994) і Cеверного Кавказу (Аматханова і ін., 2004) розподіл фінгерпрінтних локусів ДНК і аллозімних локусів білків відповідає розподілу Харді-Вайнберга, що свідчить
про високій частці вкладу статевої рекомбінації в мінливість популяцій. В інших регіонах Росії відповідності розподілу Харді-Вайнберга в популяціях не виявлено, але показано наявність неравновесного зчеплення, що свідчить про переважання клонального розмноження (Еланский і ін., 1999).
5) Генетична різноманітність (GST) між штамами, які мають різні типи спаровування (А1 і А2), було нижчим, ніж між різними популяціями (Sujkowski et al., 1994), що побічно свідчить про статеві схрещування.
У той же час внесок статевої рекомбінації в популяційної різноманітність не може бути дуже високим. Підрахунок цього вкладу був зроблений для популяцій Московської області (Еланский і ін., 1999). За розрахунками Левонтін (1979) «рекомбінація, яка може продукувати нові варіанти з двох локусів з частотою, що не перевищує твір їх гетерозиготних, стає ефективною тільки в тому випадку, якщо величини гетерозиготности по обом аллелям вже високі».
При звичайному для Московської області співвідношенні двох типів спарювання, що дорівнює 4: 1, частота рекомбінації складе 0,25. Імовірність того, що перехресні штами будуть гетерозиготних за двома з трьох вивчених ізоферментних локусів, в досліджених популяціях склала 0,01 (2 штаму з 177). Отже, ймовірність виникнення подвійних гетерозигот в результаті рекомбінації не повинна перевищувати їх твір, помножене на ймовірність схрещування (0,25х0,02х0,02) = 10-4, тобто статеві рекомбінанти зазвичай не потрапляють в досліджену вибірку штамів. Ці розрахунки зроблені для популяцій з Московської області, що характеризуються відносно високою варіабельністю. У мономорфних популяціях, подібних сибірським, статевий процес, якщо навіть і відбувається в окремих популяціях, не може вплинути на їх генетичну різноманітність.
Крім того, для P. infestans характерні часті порушення розходження хромосом в мейозі, що призводить до анеуплоїдії (Carter et al., 1999). Такі порушення знижують фертильність гібридів.
Парасексуальними рекомбінація, мітотична конверсія генів
В експериментах по зрощенню штамів P. infestans, що мають мутації резистентний до різних інгібіторів росту, було виявлено вознікновеніеmізолятов, стійких до обох інгібіторів (Shattock, Shaw, 1975; Дьяков, Кузовнікова, 1974; Куліш, Дьяков,
1979). Стійкі до двох інгібіторів росту штами виникали внаслідок гетерокаріотізаціі міцелію, і в цьому випадку розщеплювалися при розмноженні одноядерними зооспора (Judelson, Ge Yang, 1998), або не розщеплюється в монозооспоровом потомство, бо мали тетраплоїдні (оскільки вихідні ізоляти диплоїдні) ядра (Куліш, Дьяков , 1979). Гетерозиготні диплоидов сегрегованого з дуже низькою частотою внаслідок гаплоідізаціі, нерасхожденія хромосом і мітотичного кросинговеру (Поєдинок і ін., 1982). Частоту цих процесів можна було збільшити за допомогою певних дій на гетерозиготні диплоидов (наприклад, УФ-опроміненням проростають суперечка).
Хоча формування вегетативних гібридів має подвійну стійкість відбувається не тільки in vitro, але і в заражених сумішшю мутантів картопляних бульбах (Куліш та ін., 1978), оцінити роль парасексуальними рекомбінації в генеруванні нових генотипів в популяціях досить складно. Частота освіти сегрегантов внаслідок гаплоідізаціі, нерасхожденія хромосом і мітотичного кросинговеру без спеціальних впливів незначна (менш 10-3).
В основі виникнення гомозиготних сегрегантов гетерозиготних штамів може лежати як митотический кроссинговер, так і мітотична генна конверсія, яка у P. sojae протікає з частотою від 3 х 10-2 до 5 х 10-5 на локус в залежності від штаму (Chamnanpunt et al. , 2001).
Хоча частота виникнення гетерокаріонов і гетерозиготних диплоидов виявилася несподівано високою (досягає десятків відсотків), цей процес відбувається тільки при зрощуванні мутантних культур, отриманих з одного штаму. При використанні різних ізольованих з природи штамів гетерокаріотізація не відбувається (або відбувається з дуже низькою частотою) внаслідок наявності вегетативної несумісності (Поєдинок, Дьяков, 1981; Анікіна і ін., 1997б; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Отже, роль парасексуальними рекомбінації може бути зведена тільки до внутріклональной рекомбінації в гетерозиготних ядрах і переходу окремих генів в гомозиготний стан без статевого процесу. Цей процес може мати епідеміологічне значення у штамів, що мають рецесивну або полудомінантную мутацію стійкості до фунгіцидів. Перехід її в гомозиготний стан внаслідок парасексуальними процесу підвищить резистентність носія мутації (Долгова, Дьяков, 1986).
інтрогресія генів
Гетероталлічние види Phytophthora здатні схрещуватися з утворенням гібридних ооспор (див. Воробйова, Гриднев, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Природний гібрид двох видів Phytophthora виявився настільки агресивним, що знищив тисячі примірників вільхи в Великобританії (Brasier et al., 1999). P. infestans може зустрічатися з іншими видами роду (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum і ін.) На загальних рослинах-господарях і в грунті, але про можливість виникнення міжвидових гібридів в літературі мало відомостей. У лабораторних умовах були отримані гібриди між P. infestans і P. Mirabilis (Goodwin, Fry, 1994).
Таблиця 9. Частка штамів P. infestans з А2 типом спаровування в різних країнах світу в період з 1990 по 2000 роки (за даними відкритих літературних джерел і сайтів www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Країна | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Білорусь | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Бельгія | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Еквадор | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Естонія | 8 (12) | ||||||||||
Англія | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Фінляндія | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Франція | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Угорщина | 72 (32) | ||||||||||
Ірландія | 4 (145) | ||||||||||
Сівши. Ірландія | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Нідерланди | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Норвегія | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Перу | 0 (34, 1984 -86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Польща | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Шотландія | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Швеція | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Уельс | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Корея | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Китай | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Колумбія | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Уругвай | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Марокко | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербія | 76 (37) | ||||||||||
Мексика (Толука) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Таблиця 10. Частка штамів P. infestans з А2 типом спаровування в різних країнах світу в період з 2000 по 2011 роки
Країна | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Австрія | 65 (83) | ||||||||||
Білорусь | 42 (78) | ||||||||||
Бельгія | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Швейцарія | 89 (19) | ||||||||||
Чехія | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Німеччина | 95 (53) | ||||||||||
Данія | 48 (52) | ||||||||||
Еквадор | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Естонія | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Англія | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Фінляндія | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Франція | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Угорщина | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Сівши. Ірландія | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Нідерланди | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Норвегія | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Перу | 0 (36) | ||||||||||
Польща | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Шотландія | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Швеція | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Словаччина | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Уельс | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Корея | 46 (26) | ||||||||||
Бразилія | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Китай | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
В'єтнам | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Уганда | 0 (8) |
Динаміка генотипического складу популяцій
Зміни генотипического складу популяцій P. infestans можуть відбуватися під впливом міграції нових клонів з інших регіонів, агротехнічних прийомів (зміни сортів, застосування фунгіцидів) і погодних умов. Зовнішні впливи впливають неоднаково на клони, що знаходяться на різних етапах життєвого циклу, тому в популяціях щорічно протікають циклічні зміни частот генів, схильних до відбору, зумовлені зміною переважної ролі генного дрейфу і відбору.
вплив сорту
Нові сорти з ефективними генами вертикальної стійкості (R-генами) є потужним селективним фактором, що відбирає в популяціях P. infestans клони з комплементарними генами вірулентності. При відсутності у сорту картоплі неспецифічної стійкості, яка стримує зростання популяції патогена, процес зміни домінуючих в популяції клонів відбувається дуже швидко. Так, після поширення в Московській області сорти Домодедовский, що має ген стійкості R3, частота клонів, вірулентних для цього сорту, за один рік зросла з 0,2 до 0,82 (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Однак зміна частот генів вірулентності (патотіпов) в популяціях відбувається не тільки під впливом вирощуваних сортів картоплі. Наприклад, в Білорусії до 1977 р домінували клони з генами вірулентності 1 і 4, що було викликано з вирощуванням сортів картоплі, що мають гени стійкості R1 і R4 (Дорожкін, Бєльська, 1979). Однак в кінці 70-х років ХХ століття з'явилися клони, які мають різні гени вірулентності і їх поєднання, причому комплементарні їм гени стійкості ніколи не були використані в селекції картоплі (зайві гени вірулентності) (Іванюк та ін., 2002). Причина появи таких клонів, мабуть, обумовлена міграцією в Європу інфекційного матеріалу з Мексики з бульбами картоплі. На батьківщині ці клони розвивалися не тільки на культурному картоплі, але і на диких видах, несучих різноманітні гени стійкості, тому поєднання в геномі багатьох генів вірулентності було необхідно для виживання в тих умовах.
Що стосується сортів з неспецифічної стійкістю, то вони, знижуючи швидкість розмноження патогена, затримують еволюцію його популяцій, яка, як уже було сказано, є функцією чисельності. Оскільки агресивність полігенною, клони, що містять більше число генів "агресивності", накопичуються тим швидше, чим вище чисельність популяції. Тому високоагресивних раси не є продуктом адаптації до вирощуваних сортів з неспецифічної стійкістю, а навпаки, швидше за виявляються в посадках Високовоспріімчівость сортів, які є накопичувачами суперечка паразита.
Так, в Росії найбільш агресивні популяції P. Infestans виявлені в зонах щорічних епіфітотій (популяції з Сахаліну, Ленінградської, Брянської областей). Агресивність цих популяцій виявилася вищою, ніж мексиканської (Філіппов та ін., 2004).
Крім того, в листі стійких сортів формується менше ооспор, ніж в сприйнятливих (Нanson, Shattock, 1998), тобто неспецифічна стійкість сорту також знижує рекомбінаційні здатності паразита і можливість альтернативних способів зимівлі.
вплив фунгіцидів
Фунгіциди не тільки знижують чисельність фітопатогенних грибів, тобто впливають на кількісну характеристику їх популяцій, але можуть також змінювати частоти окремих генотипів, тобто впливати на якісний склад популяцій. Серед найважливіших показників популяцій, що змінюються під впливом фунгіцидів можна назвати наступні: зміна резистентності до фунгіцидів, зміна агресивності і вірулентності і зміна систем розмноження.
Вплив фунгіцидів на резистентність і агресивність популяцій
Ступінь такого впливу визначається, перш за все, типом використовуваного фунгіциду, які можна умовно розділити на полісайтовие, олігосайтовие і моносайтовие.
До перших належить більшість контактних фунгіцидів. Резистентність до них (якщо вона можлива взагалі) контролюється великим число дуже слабо експресивних генів. Ці властивості обумовлюють відсутність видимих змін резистентності популяції після обробки її фунгіцидами (хоча в деяких експериментах деяке підвищення резистентності було отримано). Грибна популяція, що збереглася після обприскувань контактними фунгіцидами, складається їх двох груп штамів:
1) Штами, що збереглися на ділянках рослин, які не оброблених препаратом. Оскільки контакту з фунгіцидом не було, агресивність і резистентність цих штамів не змінюються.
2) Штами, які контактували з фунгіцидом, концентрація якого в місцях контакту була нижче летальної. Як було сказано вище, резистентність цієї частини популяції також не змінюється, проте, внаслідок часткового шкідливої дії фунгіциду навіть в сублетальні концентрації на метаболізм грибний клітини, падає загальна пристосованості та її паразитичний компонент - агресивність (Деревягина, Дьяков, 1990).
Таким чином, навіть не загибла частина популяції, піддана контакту з фунгіцидом, має слабку агресивність і не може бути джерелом епіфітотії. Тому ретельна обробка, яка б знизила частоту не контактує з фунгіцидом частки популяції - умова успіху захисних заходів. Стійкість до олігосайтовим фунгіцидів контролюється кількома аддитивними генами.
Мутація кожного гена призводить до деякого підвищення резистентності, а загальний рівень резистентності обумовлена складанням таких мутацій. Тому підвищення резистентності відбувається поступово. Прикладом ступеневої збільшення резистентності є мутації стійкості до фунгіцидів диметоморф, широко використовується для захисту картоплі від фітофторозу. Стійкість до диметоморф полігенною і аддитивна. Однокрокової мутація незначно підвищує резистентність.
Кожна наступна мутація зменшує розмір мішені і, отже, частоту подальших мутацій (Bagirova et al., 2001). Збільшення середньої резистентності популяції після багаторазових обробок олігосайтовим фунгіцидом відбувається поступово і поступово. Швидкість цього процесу визначається, по крайней мере, трьома факторами: частотою мутації генів резистентності, коефіцієнтом резистентності (ставленням летальної дози резистентного штаму по відношенню до чутливого) і впливом мутацій генів резистентності на пристосованість.
Частота виникнення кожної наступної мутації нижче, ніж попередній, тому процес має затухаючий характер (Bagirova et al., 2001). Однак, якщо в популяції протікають рекомбінаційні процеси (статевий або парасексуальний), то можливе об'єднання в гібридному штамі різних мутацій батьків і прискорення процесу. Тому панміксние популяції набувають резистентності швидше агамное, а у останніх - популяції, що не мають бар'єрів вегетативної несумісності, швидше, ніж популяції, підрозділені такими бар'єрами. У зв'язку з цим наявність в популяціях штамів, що розрізняються типами спарювання, прискорює процес придбання резистентності до олігосайтовим фунгіцидів.
Другий і третій фактори не сприяють швидкому накопиченню резістетних до диметоморф штамів в популяціях. Кожна наступна мутація збільшує резистентність приблизно вдвічі, що незначно, і при цьому знижує як швидкість росту на штучному середовищі, так і агресивність (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Може бути тому серед природних штамів P. infestans, навіть зібраних з оброблених диметоморф посадок картоплі, практично немає резистентних.
Популяція, піддана обробці олігосайтовим фунгіцидом, також буде складатися з двох груп штамів: чи не контактували з фунгіцидом, і тому не змінили початкових ознак (якщо серед цієї групи і зустрічаються резистентні штами, вони не будуть накопичуватися внаслідок більш високої агресивності і конкурентоспроможності чутливих штамів), і штамів, які контактували з сублетальні концентраціями фунгіциду. Саме серед останніх можливе накопичення резистентних штамів, бо тут вони мають переваги перед чутливими.
Тому при використанні олігосайтових фунгіцидів важлива не стільки ретельна обробка, скільки висока концентрація препарату, в кілька разів перевищує смертельну дозу, бо при ступінчастому мутагенезі початкова резистентність мутатних штамів невелика.
Нарешті, мутації резистентності до моносайтовим фунгіцидів високо експресивні, тобто одна мутація може повідомити високий рівень резистентності до повної втрати чутливості. Тому підвищення резистентності популяцій відбувається дуже швидко.
Прикладом таких фунгіцидів можуть бути феніламідів, включаючи найбільш поширений фунгіцид металаксил. Мутації стійкості до нього виникають з високою частотою, причому ступінь резистентності у мутантів дуже висока - перевищує чутливий штам в тисячу і більше разів (Деревягина і ін., 1993). Хоча швидкість росту і агресивність резистентних мутантів знижується на тлі загибелі чутливих штамів від системного фунгіциду, чисельність резистентної популяції швидко зростає і паралельно підвищується її агресивність. Тому через кілька років використання фунгіциду агресивність резистентних штамів може не тільки зрівнятися з агресивністю чутливих, але і перевершити її (Деревягина, Дьяков, 1992).
Вплив на статеву рекомбінацію
Оскільки часте перебування типу спарювання А2 в популяціях P. infestans збіглося за часом з інтенсивним використанням металаксил проти фітофторозу, було припущено, що металаксил викликає конверсію типів спарювання. У виду P. parasitica така конверсія під дією хлоронеба і металаксил була доведена експериментально (Ко, 1994). Одноразовий пасаж на середовищі з низькою концентрацією металаксил привів до виникнення гомоталлічних ізолятів з чутливого до металаксилу штаму P. infestans з типом спаровування А1 (Savenkova, Cherepnikova-Anikina, 2002). При наступних пасажах на середовищах з більш високою концентрацією металаксил не вдалося виявити жодного ізоляту, що має тип спаровування А2, проте більшість ізолятів при схрещуванні з ізолятів А2 замість ооспор формували потворні скупчення міцелію і були стерильними. Пасажі резистентного штаму, що має тип спаровування А2, на середовищах з високою концентрацією металаксил дозволили виявити три форми змін типу спарювання: 1) повну стерильність при схрещуванні з ізолятів А1 і А2; 2) гомоталлізм (формування ооспор в монокультурі); 3) конверсія А2 типу спарювання в А1. Таким чином, металаксил може бути причиною змін типів спарювання в популяціях P. infestans і, отже, протікання в них статевої рекомбінації.
Вплив на вегетативну рекомбінацію
Деякі гени резистентності до антибіотиків збільшували частоту гетерокаріотізаціі гіф і діплоідізаціі ядер (Поєдинок, Дьяков, 1981). Як зазначено раніше, гетерокаріотізація гіф при зрощуванні різних штамів P. infestans відбувається дуже рідко внаслідок явища вегетативної несумісності у цього гриба. Однак гени стійкості до деяких антибіотиків можуть надавати побічні дії, що виражаються в подоланні вегетативної несумісності. Таким властивістю мав ген стійкості до стрептоміцину мутанта 1S-1. Наявність подібних мутантів в польових популяціях фітофтори може збільшити потік генів між штамів і прискорити адаптацію всієї популяції до нових сортів або фунгіцидів.
Деякі фунгіциди та антибіотики можуть впливати на частоту митотической рекомбінації, також здатної змінювати частоти генотипів в популяціях. Широко використовується фунгіцид Беном зв'язується з бета-тубуліну - білком, з якого побудовані мікротрубочки цитоскелета, і тим самим порушує процеси розбіжності хромосом в анафазе мітозу, збільшуючи частоту митотической рекомбінації (Hastie, 1970).
Таким же властивістю володіє фунгіцид пара-фторфенілаланін, який використовується для лікування в'язів від голландської хвороби. Пара-фторфенілаланін збільшував частоту рекомбінації і у гетерозиготних диплоидов P. infestans (Поєдинок і ін., 1982).
Циклічні зміни генотипического складу популяцій в життєвому циклі P. Infestans
Класичний цикл розвитку P. infestans в помірній зоні складається з 4-х фаз.
1) Фаза експоненціального зростання популяції (поліциклічна фаза) з короткими генераціями. Ця фаза зазвичай починається в липні і триває 1,5-2 міс.
2) Фаза зупинки зростання чисельності популяції внаслідок різкого зменшення частки непораженной тканини або настання несприятливих погодних умов. Ця фаза в господарствах, які проводять завчасне предуборочное видалення бадилля, випадає з річного циклу.
3) Фаза зимівлі в бульбах, що супроводжується значним зменшенням чисельності популяції внаслідок випадкового зараження бульб, повільного розвитку в них інфекції, відсутність при нормальних режимах зберігання перезараженія бульб, сгніванія і вибракування уражених бульб.
4) Фаза повільного розвитку в грунті і на сходах (моноциклическими фаза), при якій тривалість генерації може досягати місяця і більше (кінець травня - початок липня). Зазвичай в цей час хворі листя важко виявити навіть при спеціальних спостереженнях.
Фаза експоненціального зростання популяції (поліциклічна фаза)
Численні спостереження (Пшедецкая, Козубова, 1969; Борисенок, 1969; Оша, 1969; Дьяков, Супрун, 1984; Рибакова, Дьяков, 1990) показали, що на початку епіфітотії переважають маловірулентние і слабоагресивні клони, які в подальшому замінюються більш вірулентними і агресивними, причому швидкість росту агресивності популяції тим вище, чим менш стійкий сорт рослини-господаря.
У міру зростання чисельності популяції збільшується концентрація як селективно-важливих генів, введених в комерційні сорти (R1-R4), так і селективно нейтральних (R5-R11). Так, в підмосковних популяціях в 1993 р середня вірулентність з кінця липня до середини серпня зросла з 8,2 до 9,4, причому найбільше зростання спостерігалося для селективно нейтрального гена вірулентності R5 (з 31 до 86% вірулентних клонів) (Смирнов, 1996. ).
Зменшення швидкості росту популяції супроводжується зниженням паразитичної активності популяції. Тому в депресивні роки як загальне число рас, так і частка високовірулентних рас нижче, ніж в епіфітотійного (Борисенок, 1969). Якщо в розпал епіфітотії погодні умови змінюються на несприятливі для фітофторозу і зменшується ураженість картоплі, то концентрація високовірулентних і агресивних клонів також зменшується (Рибакова та ін., 1987).
Збільшення частот генів, що впливають на вірулентність і агресивність популяції, можливо, відбувається внаслідок відбору більш вірулентних і агресивних клонів в змішаній популяції. Для демонстрації відбору розроблений метод аналізу нейтральних мутацій, з успіхом використаний в хемостатного популяціях дріжджів (Adams et al., 1985) і Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
Частота мутантів, стійких до бластіцідіну S, в польовий популяції P. infestans падала паралельно зростанню агресивності популяції, що свідчить про зміну домінуючих клонів в процесі росту чисельності популяції (Рибакова та ін., 1987).
Фаза зимівлі в бульбах
У процесі зимівлі в бульбах картоплі вірулентність і агресивність штамів P. infestans падають, причому падіння вірулентності відбувається повільніше, ніж агресивності (Рибакова, Дьяков, 1990). Мабуть, в умовах, що сприяють швидкому зростанню чисельності популяції (r-відбору), «зайві» гени вірулентності і висока агресивність виявляються корисними, тому розвиток епіфітотії супроводжується відбором найбільш вірулентних і агресивних клонів. В умовах насичення середовища, коли велику роль набуває не швидкість розмноження, а стійкість існування в несприятливих умовах (К-відбір), «зайві» гени вірулентності і агресивність знижують пристосованість, і клони, які мають ці гени, першими вимирають, так що середня агресивність і вірулентність популяції падає.
Фаза вегетації в грунту
Ця фаза - найзагадковіша в життєвому циклі (Andrivon, 1995). Її існування постулировано чисто умоглядно - внаслідок відсутності відомостей про те, що відбувається з патогеном протягом тривалого терміну (іноді - більше місяця) - від появи сходів картоплі до виникнення на них перших плям хвороби. На основі спостережень і експериментів було реконструйовано поведінку гриба в цьому періоді життя (Hirst, Stedman, 1960; Богуславська, Філіппов, 1976).
На заражених бульбах в грунті може формуватися спороношение гриба. Утворені суперечки проростають гіфами, які можуть тривалий час вегетувати в грунті. Первинні (утворилися на бульбах) і вторинні (на міцелії в грунті) суперечки капілярними струмами піднімаються на поверхню грунту, але набувають здатність заражати картопля тільки після того, як його нижнє листя опустяться і прийдуть в контакт з поверхнею грунту. Такі листи (а саме на них виявляють перші плями хвороби) формуються не відразу, а після тривалого зростання і розвитку бадилля картоплі.
Таким чином, в життєвому циклі P. Infestans може існувати і фаза сапротрофного вегетації. Якщо в паразитичної фазі життєвого циклу агресивність є найважливішим компонентом пристосованості, то в сапротрофного фазі відбір спрямований на зниження паразитичних властивостей, як це показано експериментально для деяких фітопатогенних грибів (див. Carson, 1993). Тому в цій фазі циклу агресивні властивості повинні губитися найбільш інтенсивно. Але поки прямих експериментів, що підтверджують висловлені припущення, не проведено.
Сезонні зміни зачіпають не тільки патогенні властивості P. infestans, але і резистентність до фунгіцидів, яка в поліциклічної фазі (в період епіфітотій) зростає, а в період зимового зберігання - падає (Деревягина і ін., 1991; Kadish, Cohen, 1992). Особливо інтенсивне падіння резистентності до металаксилу спостерігалося в період між висадкою уражених бульб і появою перших плям хвороби в поле.
Внутрішньовидова спеціалізація і її еволюція
P. infestans викликає епідемії на двох комерційно важливих культурах - картоплі і томаті. Епіфітотії на картоплі почалися незабаром після попадання гриба в нові райони. Поразка томата було відзначено також незабаром після появи інфекції на картоплі, але епіфітотії на томаті були відзначені лише через сто років - в середині ХХ століття. Ось що пишуть про поразку томатів в США Галлеглі і Нідерхаузер
(1962): «Протягом приблизно 100 років після сильної епіфітотії 1845 р мало або майже зовсім не робилося спроб отримання стійких сортів томата. Хоча вперше фітофтороз зареєстрований на томатах ще в 1848 р, він не став на цю рослину об'єктом серйозної уваги селекціонерів аж до сильного спалаху хвороби в 1946 р ». На території Росії фітофтороз томата був зареєстрований ще в XIX столітті. «На це захворювання довгий час дослідники не звертали уваги, так як воно не завдавало суттєвого економічного збитку. Але в 60-70х рр. XX століття епіфітотії фітофторозу на томаті спостерігаються і в Радянському Союзі, головним чином в Нижньому Поволжі, на Україні, Північному Кавказі, в Молдові ... »(Балашова, 1979).
З тих пір поразки томата фітофторозом стали щорічними, поширилися по всій території промислового та присадибного культивування і викликають величезний економічний збиток цій культурі. Що ж сталося? Чому перша поява паразита на картоплі і епіфітотійний поразка цієї культури відбулися майже одночасно, а для виникнення епіфітотії на томаті знадобилося століття? Ці відмінності свідчать на користь мексиканського, а не американського джерела інфекції. Якщо вид Phytophthora infestans сформувався як паразит мексиканських клубненосного видів роду Solanum, то зрозуміло, чому настільки сильно здивувався культурний картопля, що відноситься до тієї ж секції роду, що і мексиканські види, але внаслідок відсутності коеволюції з паразитом, що не виробив механізмів специфічної і неспецифічної стійкості.
Томат відноситься до іншої секції роду, тип його обміну має суттєві відмінності від клубненосного видів, тому, незважаючи на те, що томат чи не знаходиться за межами харчову спеціалізацію P. infestans, інтенсивність його поразки була недостатньою для серйозних економічних втрат.
Виникнення епіфітотій на томаті обумовлено серйозними генетичними змінами паразита, що підвищили його пристосованість (патогенність) при паразитуванні. Ми вважаємо, що нова, спеціалізована для паразитування на томаті форма - це описана М. Галлеглі раса Т1, що вражає сорти вішневідние томата (Red Cherry, Ottawa), стійкого до поширеної на картоплі раси Т0 (Gallegly, 1952). Мабуть, мутація (або серія мутацій), що перетворила расу Т0 в расу Т1 і привела до появи клонів, високо пристосованих до поразки томата. Як часто трапляється, підвищення патогенності до одного господаря супроводжувалося зниженням її до іншого, тобто виникла початкова, поки не повна внутрішньовидова спеціалізація - до картоплі (раса Т0) і до томату (раса Т1).
Які свідчення на користь цього припущення?
- Зустрічальність на картоплі і томаті. На листі томата раса Т1 переважає, в той час як на листках картоплі вона зустрічається рідко. За даними С.Ф.Багіровой і Т.А. Орешонковой (не опублікована) в Московській області в 1991-1992 рр зустрічальність раси Т1 в посадках картоплі склала 0%, а в посадках томата - 100%; в 1993-1995 рр - 33% і 90% відповідно; в 2001 р - 0% і 67%. Cходние дані отримані і в Ізраїлі (Cohen, 2002). Експерименти із зараженням бульб картоплі ізолятів раси Т1 та сумішшю ізолятів Т0 і Т1 показали, що ізоляти раси Т1 погано зберігаються в бульбах і витісняються ізолятів раси Т0 (Дьяков і ін., 1975; Рибакова, 1988).
2) Динаміка раси Т1 в посадках томата. Первинне зараження листя томата здійснюється ізолятів раси Т0, які домінують при аналізі інфекції в перших плямах, що утворюються на листках. Це підтверджує загальноприйняту схему міграції паразита: Основний масив інфекції з картоплі становить раса Т0, однак незначне число клонів раси Т1, що збереглися в картоплі, потрапивши на томат витісняють расу Т0 і накопичуються до кінця епіфітотії. Можливо і наявність альтернативного джерела інфекції листя томата расою Т1, не настільки потужного, як картопляні бульби і листя, але постійного. Тому на генетичну структуру популяції, що заражає томат, це джерело впливає слабо, але в подальшому обумовлює накопичення раси Т1 (Рибакова, 1988; Дьяков і ін., 1994).
3) Агресивність до картоплі і томату. Штучне зараження листя томата і картоплі ізолятів рас Т0 і Т1 показало, що перші агресивніші для картоплі, ніж для томата, а другі більш агресивні для томата, ніж для картоплі. Ці відмінності виявляються в витісненні ізолятів не "своєї" раси зі змішаної популяції при пасажах на листках в теплиці (Дьяков і ін., 1975) і в польових ділянках (Leberton et al., 1999); відмінності в мінімальної інфекційному навантаженні, латентному періоді, розмірі інфекційних плям і спорової продукції (Рибакова, 1988; Дьяков і ін., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
Агресивність ізолятів раси Т1 до сортам томата, які не мають генів стійкості, настільки висока, що ці ізоляти спороносят на листках як на живильному середовищі без некротизации зараженої тканини (Дьяков і ін., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Вірулентність для картоплі і томата. Раса Т1 вражає сорти вішневідние томата, що володіють геном стійкості Ph1, а раса Т0 не здатна вражати ці сорти, тобто володіє більш вузької вірулентністю. По відношенню до дифференциатора
R-генів картоплі спостерігається зворотна залежність, тобто штами, виділені з листя томата менш вірулентніші, ніж «картопляні» штами (табл. 11).
5) Нейтральні маркери. Про різноспрямованого внутривидовом відборі свідчить і аналіз нейтральних маркерів в популяціях P. infestans, що паразитують на картоплі і томаті. У бразильських популяціях P. infestans ізоляти з листя томата належали до клональной лінії US-1, а з листя картоплі - до лінії BR-1 (Suassuna et al., 2004). У Флориді (США) на картоплі з 1994 р почав домінувати (зустрічальність більше 90%) клон US-8, а на томаті - клони US-11 і US-17, причому ізоляти останнього агресивніші для томата, ніж для картоплі (Weingartner , Tombolato, 2004). Достовірні відмінності частот генотипів (фінгерпрінт ДНК) у ізолятів з картоплі і томата встановлені для 1200 штамів P. infestans, зібраних в США з 1989 по 1995 роки (Deahl et al., 1995).
Використання методу AFLP дозволило розділити 74 штаму, зібраних з листя картоплі і томата в 1996-1997 рр. у Франції і Швейцарії, на 7 груп. Штами з картоплі і томата чітко не розійшлися, але «картопляні» штами виявилися генетично більш різноманітні, ніж «томатні». Перші зустрічалися у всіх семи кластерах, а другі - тільки в чотирьох, що свідчить про більш спеціалізованому геномі останніх (Knapova, Gisi, 2002).
6) Механізми ізоляції. Якщо популяції паразита на двох видах рослин-господарів еволюціонують в напрямку звуження спеціалізації до «свого» господареві, то виникають різні пре- і постмейотіческіе механізми, що перешкоджають міжпопуляційних генетичним обмінів (Дьяков, Лекомцева, 1984).
У декількох роботах було досліджено вплив джерела батьківських штамів на ефективність гібридизації. При схрещуванні штамів, ізольованих з різних видів роду Solanum в Еквадорі (Oliva et al., 2002), було встановлено, що штами з типом спаровування А2 з диких пасльонових (клональная лінія ЄС-2) найгірше схрещуються зі штамами з томата (лінія ЄС -3), а найбільш ефективно схрещуються зі штамом з картоплі (ЄС-1).
Всі гібриди виявилися непатогенними. Автори вважають, що низький відсоток гібридизації і редукція патогенності у гібридів обумовлені постмейотіческімі механізмами репродуктивної ізоляції популяцій.
У дослідах Багірової з співавторами (1998) було проведено схрещування великої кількості штамів з картоплі і томату, що мають властивості рас Т0 і Т1. Найбільш високофертільнимі виявилися кроси штамів Т1хТ1, виділених з томата (36 ооспор в поле зору мікроскопа, 44% проростання ооспор), найменш ефективними - схрещування рас Т0хТ1, виділених з різних господарів (низьке число формуються і пророслих ооспор, висока частка абортивних і недорозвинених ооспор) . Ефективність кросів між ізолятів раси Т0, виділеними з картоплі, виявилася проміжної. Оскільки основний масив штамів раси Т0 вражає картопля, вона має надійне джерело зимівлі - картопляні бульби, внаслідок чого значення ооспор як зимуючих інфекційних одиниць для популяцій з картоплі невисоко. Адаптована «томатна форма» здатна зимувати на томаті в формі ооспор (див. Нижче) і тому зберігає більш високу продуктивність статевого процесу. За рахунок високої фертильності Т1 набуває самостійний потенціал первинної інфекції на томаті. Таким же чином можна інтерпретувати результати, отримані Кнаповой з співавторами (Knapova et al., 2002). Кроси штамів, виділених з картоплі з штамами з томату, дали найвищу число ооспор - 13,8 на кв.мм. середовища (з розкидом 5-19) і проміжний відсоток проростання ооспор (6,3 с розкидом 0-24). Схрещування штамів, ізольованих з томату, дали найменший відсоток ооспор (7,6 с розкидом 4-12) при найвищому відсотку їх проростання (10,8). Кроси між штамами, виділеними з картоплі, дали проміжне число ооспор (8,6 с високим розкидом даних - 0-30) і найменший відсоток проростання ооспор (2,7). Таким чином, штами з картоплі менш фертильності, ніж з томата, але міжпопуляційних схрещування дали НЕ гірші результати, ніж внутрипопуляционной. Можливо, відмінності з наведеними вище даними Багірової з співавт. пояснюються тим, що російські дослідники працювали з штамами, ізольованими на початку 90-х років ХХ століття, а швейцарські - з штамами, ізольованими в кінці 90-х рр.
В основі низької фертильності може лежатьгетероплоідность штамів. Якщо в Мексиканських популяціях, де статевий процес і первинне зараження ооспоровим потомством регулярні, більшість досліджених штамів P. Infestans диплоїдні, то в країнах Старого Світу спостерігається внутрипопуляционной поліморфізм плоїдності (ди-, три- і тетраплоїдні штами, а також гетерокаріотіческіе штами з гетероплоіднимі ядрами) , причому штами, які мають різні типи спаровування, тобто взаємно фертильні, розрізняються плоїдності ядер (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Разноплоідность ядер в антеридиях і оогониях може бути причиною низької фертильності.
Що стосується ядерних обмінів між гіфами при анастомозах, то цьому перешкоджає вегетативна несумісність, що розбиває безстатеві популяції на безліч генетично ізольованих клонів (Поєдинок, Дьяков, 1987; Горбунова та ін., 1989; Анікіна і ін., 1997b).
7) Конвергенція популяцій. Наведені вище дані свідчать про те, що гібридизація між «картопляними» і «томатними» штамами P. infestans можливі. Також можливо реципрокное перезараження різних господарів, хоча і зі зниженою агресивністю.
Дослідження популяційних маркерів у ізолятів з розташованих поруч полів картоплі і томата в 1993 р показало, що приблизно чверть ізолятів, виділених з листя томата, була перенесена з сусіднього картопляного поля (Долгова та ін., 1997). Теоретично можна було припускати, що дивергенція популяцій на двох господарів буде посилюватися і призведе до виникнення внутрішньовидових спеціалізованих форм (f.sp. potato та f.sp. tomato), тим більше що ооспори можуть зберігатися в рослинних рештках (Drenth et al., 1995 ; Багірова, Дьяков, 1998) і насінні томата (Rubin et al., 2001). Отже, томати мають в даний час незалежний від бульб картоплі джерело весняного відновлення.
Однак все сталося інакше. Зимівля ооспор дозволила паразита уникнути самого вузького етапу в його життєвому циклі - моноциклічну стадію вегетації в грунті, при якій знижуються паразитичні властивості, поступово відновлюються влітку в поліциклічної фазі.
Таблиця 11. Частоти генів вірулентності до сортам-дифференциатора картоплі у штамів P. Infestans
Країна | рік | Середнє число генів вірулентності у штамів | Автор | |
з картоплі | з томата | |||
Франція | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999. |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998. | |
Франція, Швейцарія | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
США | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995 |
США, Зап. Вашингтон | 1996 | 4.6 | 5 | Дорранс та ін., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Еквадор | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998. |
Ізраїль | 1998 | 7 | 4.8 | Коен, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Росія, Моск. обл. | 1993 | 8.9 | 6.7 | Смирнов, 1996. |
Росія, різні області | 1995 | 9.4 | 8 | Козловська та ін. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Первинні зооспорангії і зооспори, якими проростають ооспори, мають високий ступінь паразитичної активності, особливо якщо ооспори сформувалися партеногенетически під впливом феромонів штаму, що володіє протилежним типом спаровування. Тому інфекційний матеріал на сходах томата, що виріс із заражених ооспор насіння, високо патогенний як для томата, так і для картоплі.
Ці зміни привели до чергової популяційної перебудові, що виразилася в наступних важливих з епідеміологічної точки зору зміни:
- Заражені сходи томату стали важливим джерелом первинного зараження картоплі (Філіппов, Іванюк, особисті повідомлення).
- Епіфітотії на картоплі стали спостерігатися вже в червні, приблизно на місяць раніше, ніж зазвичай.
- У посадках картоплі збільшився відсоток раси Т1, яка раніше зустрічалася там в незначній кількості (Уланова та ін., 2003).
- Штами, ізольовані з листя томата, перестали відрізнятися від штамів з картоплі по вірулентності на картопляних дифференциатора генів вірулентності і стали перевершувати «картопляні» штами по агресивності не тільки на томаті, але і на картоплі (Лаврова і ін., 2003; Уланова та ін. , 2003).
Таким чином, замість дивергенції сталася конвергенція популяцій виникнення єдиної популяції на двох рослинах-господарях з високою вірулентністю і агресивністю до обох видів.
Висновок
Отже, незважаючи на більш ніж 150-літній інтенсивне вивчення P. infestans, в біології, в тому числі, популяційної біології цього збудника найважливіших хвороб культивованих пасльонових рослин, залишається багато невідомого. Незрозуміло, як впливає на структуру популяцій проходження окремих етапів життєвого циклу, які генетичні механізми каналізованной мінливості агресивності і вірулентності, яке співвідношення статевої і клональной систем розмноження в природних популяціях, як успадковується вегетативна несумісність, яка роль картоплі і томата в первинному зараженні цих культур і в чому полягає їх вплив на структуру популяцій паразита. До сих пір не вирішені такі найважливіші для практичної діяльності питання, як генетичні механізми зміни агресивності паразита або ерозія неспецифічної стійкості картоплі. У міру поглиблення і розширення досліджень фітофторозу картоплі паразит ставить перед дослідниками все нові завдання. Однак вдосконалення експериментальних можливостей, виникнення нових методологічних підходів маніпуляції з генами і білками дозволяють сподіватися на успішне вирішення поставлених питань.
Стаття опублікована в журналі «Захист картоплі» (№3, 2017)